Гш 12: National Interest рассказал о пистолете ГШ-18 — Российская газета

National Interest рассказал о пистолете ГШ-18 — Российская газета

Российский пистолет ГШ-18 удостоился внимания американского журнала The National Interest. Автор издания Чарли Гао отметил, что творение известных тульских оружейников Василия Грязева и Аркадия Шипунова, хотя и походит на австрийский пистолет «Глок», в некоторых случаях превосходит его.

«Русский аналог «Глока» — это интересный пистолет, который включает в себя некоторые любопытные решения, которые позже были использованы самой компанией «Глок», — говорится в публикации.

По данным NI, при создании пистолета за образец был взят Glock 17. Во многом российский пистолет похож на своего зарубежного «брата» — полимерная рамка, предохранитель на спусковом крючке, ударно-спусковой механизм ударникового типа. Однако есть и отличия, среди которых стоит особо отметить механизм запирания поворотом ствола. Поворот осуществлялся за счёт взаимодействия выступа на казённой части ствола с копирным пазом вкладыша рамки пистолета. В передней части затвора неподвижно закреплена вкладная муфта с 10 парными боевыми упорами для сцепления затвора со стволом. Угол поворота ствола при запирании составляет всего 18 градусов.

Конструкция ГШ-18 была доработана к 2000 году, и пистолет успешно прошел все государственные испытания. Он принят на вооружение ряда спецподразделений, которые нуждаются в более современном пистолете, чем знаменитый ПМ. Благодаря оригинальной конструкции, ГШ-18 при стрельбе уводит вверх намного меньше, чем ПМ, что это обеспечивает хорошую кучность. Однако есть и недостаток — тугой спуск, непривычный для большинства стрелков.

Добавим, что отечественный пистолет превосходит австрийский «Глок» в надежности при эксплуатации в тяжелых условиях. Проблема иностранного пистолета заключается в капризном двухрядном магазине на 17 патронов, который «боится» грязи и пыли. Пистолет сразу клинит. Зато ГШ-18 способен стрелять с нечищеным магазином и в любую погоду.

Штатные патроны 7Н31 калибром 9 миллиметров гарантированно пробивают общевойсковой бронежилет на дальности до 30 метров. Начальная скорость пули — 600 метров в секунду. Вес пистолета с полным магазином — 800 граммов.

Glock 17. Фото: Askild Antonsen / wikimedia.org

Структура Минобороны России : Министерство обороны Российской Федерации

МИНИСТР ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
	Генерал армии Шойгу Сергей Кужугетович
ЗАМЕСТИТЕЛИ МИНИСТРА ОБОРОНЫ РОССИИ
	Начальник Генерального штаба Вооруженных Сил РФ — первый заместитель Министра обороны Российской Федерации генерал армии Герасимов Валерий Васильевич
	Первый заместитель Министра обороны Российской Федерации Цаликов Руслан Хаджисмелович
	Статс-секретарь — заместитель Министра обороны Российской Федерации Панков Николай Александрович
	Заместитель Министра обороны Россйской Федерации — начальник Главного военно-политического управления Вооруженных Сил Российской Федерации генерал-полковник Картаполов Андрей Валериевич
	Заместитель Министра обороны Российской Федерации — руководитель Аппарата Министра обороны Российской Федерации генерал-полковник Садовенко Юрий Эдуардович
	Заместитель Министра обороны Российской Федерации генерал армии Булгаков Дмитрий Витальевич
	Заместитель Министра обороны Российской Федерации генерал-лейтенант Евкуров Юнус-Бек Баматгиреевич
	Заместитель Министра обороны Российской Федерации Иванов Тимур Вадимович
	Заместитель Министра обороны Российской Федерации Криворучко Алексей Юрьевич
	Заместитель Министра обороны Российской Федерации генерал армии Попов Павел Анатольевич
	Заместитель Министра обороны Российской Федерации Фомин Александр Васильевич
	Заместитель Министра обороны Российской Федерации Шевцова Татьяна Викторовна
ГЕНЕРАЛЬНЫЙ ШТАБ ВООРУЖЕННЫХ СИЛ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
	Главное оперативное управление ГШ ВС РФ
	Главное управление ГШ ВС РФ
	Главное организационно-мобилизационное управление ГШ ВС РФ
	Главное управление связи ВС РФ
	Национальный центр управления обороной Российской Федерации
	Управление начальника войск радиоэлектронной борьбы ВС РФ
	Военно-топографическое управление ГШ ВС РФ
	Восьмое управление ГШ ВС РФ
	Управление оперативной подготовки ВС РФ
	Управление (строительства и развития системы применения беспилотных летательных аппаратов) ГШ ВС РФ
	Архивная служба ВС РФ
ГЛАВНЫЕ УПРАВЛЕНИЯ
	Главное управление боевой подготовки ВС РФ
	Главное управление военной полиции Минобороны России
	Главное управление кадров Минобороны России
	Главное управление международного военного сотрудничества Минобороны России
	Главное управление вооружения ВС РФ
	Главное автобронетанковое управление Минобороны России
	Главное ракетно-артиллерийское управление Минобороны России
	Главное управление начальника Железнодорожных войск Минобороны России
	Главное военно-медицинское управление Минобороны России
	Главное управление научно-исследовательской деятельности и технологического сопровождения передовых технологий (инновационных исследований) Минобороны России
	Главное управление контрольной и надзорной деятельности Министерства обороны Российской Федерации
	Главное военно-политическое управление Вооруженных Сил Российской Федерации
УПРАВЛЕНИЯ
	Управление начальника войск радиационной, химической и биологической защиты ВС РФ
	Управление начальника инженерных войск ВС РФ
	Управление службы войск и безопасности военной службы Минобороны России
	Управление государственного надзора за ядерной и радиационной безопасностью Минобороны России
	Управление физической подготовки и спорта ВС РФ
	Управление военных представительств Минобороны России
	Управление Минобороны России по увековечению памяти погибших при защите Отечества
	Управление Минобороны России по контролю за выполнением договоров (Национальный центр по уменьшению ядерной опасности)
	Управление метрологии ВС РФ
	Управление Минобороны России по мониторингу системы материально-технического обеспечения
	Федеральное управление накопительно-ипотечной системы жилищного обеспечения военнослужащих
	Управление делами Минобороны России
	Организационное управление Минобороны России
	Управление Минобороны России по работе с обращениями граждан (общественная приёмная Министра обороны Российской Федерации)
	Контрольное управление Минобороны России
	Управление интеллектуальной собственности, военно-технического сотрудничества и экспертизы поставок вооружения и военной техники  Минобороны России
	Управление перспективных межвидовых исследований и специальных проектов Минобороны России
	Управление заказов по совершенствованию технической основы системы управления ВС РФ
	Государственная экспертиза Минобороны России
	Военно-научный комитет ВС РФ
	Научно-технический комитет (развития вооружений)
ДЕПАРТАМЕНТЫ
	Штаб материально-технического обеспечения Вооруженных Сил Российской Федерации
	Департамент ресурсного обеспечения Минобороны России
	Департамент транспортного обеспечения Минобороны России
	Департамент  планирования и координации обустройства войск (сил) Минобороны России
	Департамент строительства Минобороны России
	Департамент жилищного обеспечения и управления жилищным фондом Минобороны России
	Департамент военного имущества Минобороны России
	Департамент финансового обеспечения Минобороны России
	Департамент финансового планирования Министерства обороны Российской Федерации
	Департамент социальных гарантий Министерства обороны Российской Федерации
	Департамент эксплуатационного содержания и обеспечения коммунальными услугами воинских частей и организаций Минобороны России
	Департамент информации и массовых коммуникаций Минобороны России
	Пресс-секретарь Министра обороны Российской Федерации
	Правовой департамент Минобороны России
	Протокольно-координационный департамент Министерства обороны Российской Федерации
	Департамент государственных закупок Минобороны России
	Департамент Министерства обороны Российской Федерации по обеспечению государственного оборонного заказа
	Департамент военно-экономического анализа Министерства обороны Российской Федерации
	Департамент аудита государственных контрактов Министерства обороны Российской Федерации
	Департамент ведомственного финансового контроля и аудита Министерства обороны Российской Федерации
	Департамент финансового мониторинга государственного оборонного заказа Минобороны России
	Департамент культуры Минобороны России
	Департамент информационных систем Министерства обороны Российской Федерации
	Департамент психологической работы Министерства обороны Российской Федерации
СЛУЖБЫ
	Служба безопасности полетов авиации ВС РФ
	Военно-оркестровая служба ВС РФ
	Военно-геральдическая служба ВС РФ
	Гидрометеорологическая служба ВС РФ
ГЛАВНЫЕ КОМАНДОВАНИЯ
	Главное командование Сухопутных войск
	Главное командование Воздушно-космических сил
	Главное командование Военно-Морского Флота
КОМАНДОВАНИЯ
	Командование Ракетных войск стратегического назначения
	Командование Воздушно-десантных войск

Уголок лат гш 12

Цена

Артикул:

Текст:

Выберите категорию: Все Насосное оборудование » Водяные насосы »» Скважинные насосы »»» Насос центробежный 4″ (TF) BELAMOS »»» Насос вихревой 4″ (ТM) BELAMOS »»» Скважинный насос 4TS/TF BELAMOS (увеличенная производительность, 380 В) »»» Скважинные насосы ЭЦВ (380 В) »»»» ЭЦВ 4 »»»» ЭЦВ 5 »»»» ЭЦВ 6 »»»» ЭЦВ 8 »»»» ЭЦВ 10 »»»» ЭЦВ 12 »»» Насос центробежный 3″ (TF3) BELAMOS »»» Насос центробежный 2-2. 5′ (TF) BELAMOS »»» Насос центробежный 3″ (3TF) BELAMOS »»» Насос центробежный 3″ (JNR) BELAMOS »»» Насос винтовой 3″ (3SP) Belamos »»» Насос винтовой 4″ (SP) BELAMOS »»» Скважинные насосы Водомет »»» Насос цетробежный Grundfos »»» Скважинные насосы (прочее) »»» Винтовые скважинные насосы QGB »»» Насос скважинный 3 »»» Насос скважинный Оазис »»» Насос центробежный AL-KO »»» Скважинный насос 5 дюймов TF BELAMOS (увеличенная производительность, 380 В) »»» Скважинный насос 6 дюймов TF/TR BELAMOS (увеличенная производительность, 380 В) »»» Скважинные насосы AQUARIO »»»» Скважинные насосы ASP (220V) »»» Скважинные насосы 380 В »»»» Cкважинные насосы ASP (T) 380 B »» Станции водоснабжения »»» Насосные станции Беламос »»» Насосные станции Джилекс »»» Насосные станции AL-KO »»» Станции водоснабжения (прочее) »»» Установки водоснабжения Grundfos »»» Насосные станции AQUARIO »» Насосы дренажные »»» Насосы дренажные DWP (Для тяжелых условий эксплуатации) »»» Насосы дренажные Omega (Для чистой и слабозагрязненной воды) »»» Насосы дренажные и фекальные Джилекс »»» Погружные насосы для чистой воды AL-KO »»» Погружные насосы для грязной воды AL-KO »»» Дренажные насосы Grundfos »»» Насосы дренажные промышленные »»» Насосы фекальные и дренажные JEMIX »» Поверхностные насосы »»» Многоступенчатые поверхностные насосы »»» Моноблочные центробежные насосы »» Циркуляционные насосы »»» Насосы циркуляционные промышленные »» Канализационная установка »» Вибрационные насосы »» Насосы фонтанные Беламос XF »» Насос повышающий давление »» Насосы для пруда »» Трюмные насосы » Автоматика к насосу »» Стабилизаторы / ИБП »» Реле давления »» Устройства защиты насоса (Частнотный преобразователь / Плавный пуск/УЗО) »»» Частотные преобразователи »» Приборы защиты по давлению (реле сухого хода, контроллеры) »» Комплексное решение автоматизации на баке (КРАБ) »» Манометры » Принадлежности к насосам »» Фильтр для насоса »» Обратный клапан »» Подводка 1 » Гидроаккумуляторы » Экспанзоматы (расширительные баки) » Генератор » Мотопомпы »» Для грязной воды »» Для чистой воды » Насосы для дизтоплива Товары для бурения скважин на воду » Комплектующие для бурения » Обсадные трубы » Веревка и трос »» Трос ср. мягкости нер AISI304 »» Веревка полиамидная (16 прядная) »» Веревка полиамидная (24 прядная) »» Веревка хозяйственная »» Трос в ПВХ оплетке » Сетка »» Сетка нержавеющая »» Полиамидная сетка »» Москитная сетка »» Сетка сварная ТУ127500-245-00187211-96 » Инструмент для бурения скважин на воду Все для полива » Шланги для полива и комплектующие »» Шланги ПВХ ТД Родионов »» Шланги ПВХ Rehau »» Шланги ПВХ Belamos »» Комплектующие для шланга »» Рукав пожарный, напорный » Капельный полив » Садовая трубка и комплектующие » Внутрипочвенная система полива » Комплект для подачи удобрения (Ижектор Вентури) » Дождевание (туманнообразование) » Спрей-полив » Автоматическая система полива Трубы и фитинги » Трубы и фитинги ПЭ питьевые (ПНД и ПВД) »» Кран шаровый пластиковый » Трубы и фитинги ПП » Труба и фитинги для внутренней канализации » Трубы и фитинги для наружной канализации » Фитинг (латунь) » Фитинг (чугун) » Фитинг (сталь) » Краны шаровые » Обсадные трубы НПВХ Краны шаровые латунные » Кран шаровый импорт »» Кран шаровый Лайт »» Кран шаровый имп г/ш » Кран шаровый вварной LD » Кран шаровый угловой F. I.V » Кран шаровый со штуцером » Кран шаровый LD Pride »» Кран шаровый с накидной гайкой LD Pride »» Кран шаровый LD Pride г/ш »» Кран шаровый LD Pride » Кран шаровый ГАЛЛОП »» Кран шаровый ГАЛЛОП г/ш »» Кран шаровый ГАЛЛОП г/г Фильтр для воды » Фильтрующие элементы для скважины » Фильтра для насоса » Магистральные фильтра и картриджи »» Магистральные корпуса »» Картридж для магистральных корпусов »»» Картридж адсорбционный »»» Картридж мех. очистка »»» Картридж ионнообменный для умягчения »»» Картридж противожелезистый »» Системы обратного осмоса »»» Комплектующие к обратному осмосу »» Фильтр первичной очистки воды »»» Латунный фильтр »»» Пластиковый фильтр »»»» Дисковый »»»» Сетчатый »» Системы для коттеджей »»» Клапан управления фильтром для чистки воды »»» Магнитные преобразователи воды »»» Колонны (Стекловолокно) »»» УФ для обеззараживания воды »»» Фильтрующий материал »»» Запчасти к колоннам и клапанам управления »»» Солевые баки и емкости Товары для монтажа отопления » Радиаторы отопления » Котлы электрические »» Котел электрический Bosch »» Электрокотлы ZOTA »» Электрические теловентиляторы BELAMOS » Котлы твердотопливные »» Котлы твердотопливные Buderus »» Котлы твердотопливные BOSCH ТТ »» Котлы твердотопливные ZOTA » Круг отрезной » Буры Сантехнические товары » Водосчетчики » Смесители и комплектующие »» Смесители POTATO »» Смесители Эверест »» Смесители Calorie »» Комплектующие к смесителю » Гибкая подводка »» Подводка к смесителю »» Подводка г/ш »» Подводка г/г » Водонагреватели » Комплектующие к стир/машине Тачки садовые, строительные » Запасные части к тачкам Товары для водоснабжения в доме Принадлежности к насосам » Уплотнительные материалы » Автоматика к насосу » Латунные фитинги » Веревка и трос »» веревка хозяйственная »» Трос ср. мягкости нер AISI304 »» Веревка полиамидная (16 прядная) »» Веревка полиамидная (24 прядная) »» Трос в ПВХ оплетке » Кабель для насоса, крепеж »» Крепеж Комплектующие для обвязки скважины

Производитель: ВсеBelamosBuderusValfexZotaБелоруссияДжилексРоссияРотатоСантехмастерГельТД «Родионов»Чешская РеспубликаЭверест

Новинка: Вседанет

Спецпредложение: Вседанет

Результатов на странице: 5203550658095

Найти

Шкаф-купе ГШ-23-4-12-55, 2 зеркала Ноче гварнери в Томске приобрести по низкой стоимости за 21611 р

Характеристики шкаф-купе ГШ-23-4-12-55, 2 зеркала Ноче гварнери

Категория	Шкафы в прихожую
Тип шкафа	Шкаф купе
Ширина	120.2 см
Глубина	45 см
Высота	230 см
Материал	ДСП
Тип поверхности	Матовая
Особенности шкафа	С зеркалом
Расположение шкафа	Напольный
Стиль	Современный
Цвет	Коричневый
Производитель	Россия
Количество дверей	Две
Назначение шкафа	Для одежды
Гарантия производителя	24 месяца
Вес / Объем	Расчитать для доставки

Описание шкаф-купе ГШ-23-4-12-55, 2 зеркала Ноче гварнери

Возможен выбор цветого решения!

Варианты представлены в разделе фотографий!

Необходимый цвет укажите в комметарий к заказу!

Информация о доставке шкаф-купе ГШ-23-4-12-55, 2 зеркала Ноче гварнери

Способ доставки	Описание
Самовывоз	Бесплатно — самостоятельный вывоз с пункта выдачи. Пункт выдачи расположен по адресу г. Томск, ул. Нижне-Луговая, 87, стр. 1. Режим работы: пн — пт, c 09:00 по 19:00, сб, c 10:00 по 16:00. Всего пунктов: 6 получения готовой мебели (посмотреть)
Доставка до подъезда дома из пункта выдачи	Время доставки согласуется дополнительно. Выгрузка из машины и подъём на нужный этаж осуществляется Вами лично, либо за дополнительную плату после согласования с менеджером.
Доставка по РФ	Рассчитывается индивидуально после оформлении заказа на сайте

*Дополнительную информацию о том, как купить шкаф-купе ГШ-23-4-12-55, 2 зеркала Ноче гварнери в Томске уточняйте у нашего менеджера по телефону 8800-333-58-61

Задать вопрос о шкаф-купе ГШ-23-4-12-55, 2 зеркала Ноче гварнери

— Укажите свое имя

— Укажите вопрос

— Укажите телефон или адрес электронной почты

Шкаф-купе ГШ-24-4-12-15, Ноче гварнери в Томске приобрести по низкой стоимости за 22220 р

Характеристики шкаф-купе ГШ-24-4-12-15, Ноче гварнери

Категория	Шкафы в прихожую
Тип шкафа	Шкаф купе
Ширина	120.2 см
Глубина	45 см
Высота	240 см
Материал	ДСП
Тип поверхности	Матовая
Особенности шкафа	С зеркалом
Расположение шкафа	Напольный
Стиль	Современный
Цвет	Коричневый
Производитель	Россия
Количество дверей	Две
Назначение шкафа	Для одежды
Гарантия производителя	24 месяца
Вес / Объем	Расчитать для доставки

Описание шкаф-купе ГШ-24-4-12-15, Ноче гварнери

Возможен выбор цветого решения!

Варианты представлены в разделе фотографий!

Необходимый цвет укажите в комметарий к заказу!

Информация о доставке шкаф-купе ГШ-24-4-12-15, Ноче гварнери

Способ доставки	Описание
Самовывоз	Бесплатно — самостоятельный вывоз с пункта выдачи. Пункт выдачи расположен по адресу г. Томск, ул. Нижне-Луговая, 87, стр. 1. Режим работы: пн — пт, c 09:00 по 19:00, сб, c 10:00 по 16:00. Всего пунктов: 6 получения готовой мебели (посмотреть)
Доставка до подъезда дома из пункта выдачи	Время доставки согласуется дополнительно. Выгрузка из машины и подъём на нужный этаж осуществляется Вами лично, либо за дополнительную плату после согласования с менеджером.
Доставка по РФ	Рассчитывается индивидуально после оформлении заказа на сайте

*Дополнительную информацию о том, как купить шкаф-купе ГШ-24-4-12-15, Ноче гварнери в Томске уточняйте у нашего менеджера по телефону 8800-333-58-61

Задать вопрос о шкаф-купе ГШ-24-4-12-15, Ноче гварнери

— Укажите свое имя

— Укажите вопрос

— Укажите телефон или адрес электронной почты

Победой команд 8 управления ГШ ВС РФ и НЦУО финишировали соревнования по легкой атлетике на Спартакиаде МО РФ среди ЦОВУ

В течении двух дней в легкоатлетическом манеже КЛФК ЦСКА в рамках Спартакиады Министерства обороны России среди команд Центральных органов военного управления проходил турнир по легкой атлетике.

Более 240 военнослужащих из 26 команд ЦОВУ соревновались в беге на короткие и длинные дистанции. Финалом турнира стала эстафета 8х400 м.

Команды были разделены на 2 группы, личные забеги легкоатлетов проходили в 5 возрастных группах – старше 50 лет, старше 45 лет, до 45 лет, до 40 лет и до 35 лет.

Сегодня, 3 сентября, в ходе эстафеты развернулась яркая и волевая борьба за титул победителей соревнования.

В личном первенстве в 1 группе победу в забеге на 60 метров одержали Алексей Масков (К РВСН), Игорь Рекин (12 ГУ МО РФ), Андрей Андреев (УКО МО РФ), Иван Мошуров (ГВЦ ВС РФ)

Золотых медалей в спринтерском беге на 60 метров во 2 группе удостоены Виктор Громов (СБПА ВС РФ), Андрей Ващенко (8 У ГШ ВС РФ), Александр Емельянов (НЦУЯО), Сергей Соколов (9 У МО РФ) и Денис Хохлов (ГАБТУ МО РФ).

Лучшими в забеге на 100 метров стали Эдуард Сафиулин (К ВДВ) и Игорь Хващенко (НЦУЯО).

1000-метровая дистанция в своих возрастных группах покорилась Эдуарду Сафиулину (К ВДВ), Юрию Бабко (ГАБТУ МО РФ), Андрею Третьякову (ГК СВ), Андрею Толикову (ГУН ЖДВ), Руслану Ульяненькову (12 ГУ МО РФ) и Павлу Соколову (8 У ГШ ВС РФ).

Победу на дистанции 3000 метров одержали Виталий Щвец (12 ГУ МО РФ), Василий Головин (8 У ГШ МО РФ) и Андрей Долматов (ГУН ЖДВ).

Первыми к финишу эстафетной гонки пришла команда 8 Управления Генерального штаба ВС РФ.

Они же стали победителями турнира во второй группе, набрав по сумме 4 легкоатлетических забегов 758 баллов. Второй результат и 743 балла показала команда Главного управления начальника Железнодорожных войск. Замкнули тройку лидеров легкоатлеты команды Управления государственного надзора за ядерной и радиационной безопасностью.

Кубок за первое место в 1 группе присужден команде Национального центра управления обороной (745 баллов). С отрывом в 2 балла на вторую ступень пьедестала почета поднялись военнослужащие 12 Управления Генерального штаба МО РФ.

Награждение победителей и призеров турнира провели заместитель начальника отдела – начальник группы отдела физической подготовки Управления физической подготовки и спорта Вооружённых Сил РФ полковник Алексей Щадин и начальник команды – старший тренер спортивной команды ЦСКА (по легкой атлетике) подполковник Елена Донькина.

Глава ГШ ВС Армении: Информация о применении ракет «Искандер» в Карабахе не подлежит разглашению | 1news.az

Начальник главного штаба вооруженных сил Армении Артак Давтян отказался комментировать возможное применение армянской стороной комплексов «Искандер» в период войны в Карабахе осенью 2020 года.

Об этом 1news.az сообщает со ссылкой на Интерфакс.

«Не могу ничего сказать, поскольку информация не подлежит разглашению», — сказал Давтян журналистам в пятницу, 2 апреля.

Отметим, что накануне представитель Агентства по разминированию (ANAMA) заявил об обнаружении обломков ракет «Искандер», использованных Арменией в ходе войны в Карабахе осенью 2020 года, были также представлены фотографии частей ракет.

Обломки ракет были продемонстрированы в пятницу, 2 апреля, на территории ОАО «Азерландшафт» представителями ANAMA.

При этом ранее Армения опровергла утверждение о применении «Искандеров» в ходе последнего конфликта, хотя до этого премьер Никол Пашинян заявлял о том, что Иреван якобы использовал их.

Представитель ANAMA также заявил журналистам, что фрагменты двух ракет были обнаружены в городе Шуша 15 марта при проведении очистки территорий от мин. Он сообщил, что географические координаты обломков ракет следующие: 39°45’38.10″N 46°44’33.90″E и 39°45’27.80″N 46°45’25.80″E.

«В ходе проверки специалистами Агентства опознавательного номера (9М723) ракеты было установлено, что ее обломки принадлежат ракетному комплексу «Искандер». Даже при поиске в открытых интернет-ресурсах можно определить, что идентификационный номер 9М723 принадлежит ракете «Искандер». Все это подтверждает, что в период Отечественной войны, в частности, для уничтожения города Шуша, Армения использовала против Азербайджана ракеты «Искандер», — сказал представитель ANAMA.

Зажим рычага GSH 120/60

Количество:

1 шт. 2 шт. 3 шт. 4 шт. 5 шт. 6 шт. 7 шт. 8 шт. 9 шт. 10 шт. 11 шт. 12 шт. 13 шт. 14 штук, 15 штук, 16 штук, 17 штук, 18 штук, 19 штук, 20 штук, 21 штук, 22 штук, 23 штук, 24 штук, 25 штук, 26 штук, 27 штук, 28 штук, 29 штук. 30 шт., 31 шт., 32 шт., 33 шт., 34 шт., 35 шт., 36 шт., 37 шт., 38 шт., 39 шт., 40 шт., 41 предмет, 42 шт., 43 шт., 44 шт., 45 шт., 46 шт. 47 предметов, 48 предметов, 49 предметов, 50 предметов, 51 предмет, 52 предмета, 53 предмета, 54 предмета, 55 предметов, 56 предметов, 57 предметов, 58 предметов, 59 предметов, 60 предметов, 61 предмет, 62 предмета 63 Шт.64 предмета, 65 предмета, 66 предмета, 67 предмета, 68 предмета, 69 предмета, 70 предмета, 71 предмет, 72 предмета, 73 предмета, 74 предмета, 75 предмета, 76 предмета, 77 предмета, 78 предмета, 79 предмета, 80 предмета 0,81 предмет, 82 предмет, 83 предмет, 84 предмет, 85 предмет, 86 предмет, 87 предмет, 88 предмет, 89 предмет, 90 предмет, 91 предмет, 92 предмет, 93 предмет, 94 предмет, 95 предмет, 96 предмет, 97 98 штук, 99 штук, 100 штук, 101 штук, 102 штук, 103 штук, 104 штук, 105 штук, 106 штук, 107 штук, 108 штук, 109 штук, 110 штук, 111 штук, 112 штук, 113 штук. 114 шт.115 шт.116 шт.117 шт.118 шт.119 шт.120 шт.121 шт.122 шт.123 шт.124 шт.125 шт. 126 шт.127 шт.128 шт. 129 шт. 130 шт. .131 шт.132 шт.133 шт.134 шт.135 шт.136 шт.137 шт.138 шт.139 шт.140 шт.141 шт.142 шт.143 шт.144 шт.145 шт.146 шт.147 шт.148 шт. 0,149 шт. 150 шт. 151 шт. 152 шт. 153 шт. 154 шт. 155 шт. 156 шт. 157 шт. 158 шт. 159 шт. 160 шт. 161 шт. 162 шт. 163 шт. 164 шт. 165 166 шт. 167 шт. 168 шт. 169 шт. 170 шт. 171 шт. 172 шт. 173 шт. 174 шт. 175 шт. 176 шт. 177 шт. 178 шт. 179 шт. 180 шт. 181 шт. 182 шт.183 шт.184 шт.185 шт.186 шт.187 шт.188 шт.189 шт.190 шт.191 шт.192 шт.193 шт.194 шт.195 шт., 196 шт., 197 шт. 198 шт., 199 шт. 200 шт. 201 шт., 202 шт., 203 шт., 204 шт., 205 шт., 206 шт., 207 шт., 208 шт., 209 шт., 210 шт., 211 шт. .212 шт., 213 шт., 214 шт., 215 шт., 216 шт., 217 шт., 218 шт., 219 шт., 220 шт., 221 шт., 222 шт., 223 шт., 224 шт., 225 шт. , 226 шт., 227 шт., 228 229 шт. 230 шт. 231 шт. 232 шт. 233 шт. 234 шт. 235 шт., 236 шт. 237 шт. 238 шт. 239 шт., 240 шт., 241 шт., 242 шт., 243 шт., 244 шт. 245 шт., 246 шт., 247 шт., 248 шт., 249 шт., 250 шт., 251 шт., 252 шт., 253 шт., 254 шт., 255 шт., 256 шт., 257 шт.258 шт., 259 шт., 260 шт., 261 шт., 262 шт., 263 шт., 264 шт., 265 шт., 266 шт., 267 шт., 268 шт., 269 шт., 270 шт., 271 шт., 272 шт., 273 шт., 274 шт. .275 шт., 276 шт., 277 шт., 278 шт., 279 шт., 280 шт., 281 шт., 282 шт., 283 шт., 284 шт., 285 шт., 286 шт., 287 шт., 288 шт., 289 шт., 290 шт. 291 292 шт. 293 шт. 294 шт. 295 шт. 296 шт. 297 шт. 298 шт. 299 шт. 300 шт. 301 шт. 302 шт. 303 шт. 304 шт. 305 шт. 306 шт. 307 шт. 308 шт. 309 шт. 310 шт. 311 шт., 312 шт., 313 шт. 314 шт., 315 шт., 316 шт., 317 шт., 318 шт., 319 шт., 320 шт.321 шт., 322 шт., 323 шт., 324 шт., 325 шт., 326 шт., 327 шт., 328 шт., 329 шт., 330 шт., 331 шт., 332 шт., 333 шт., 334 шт., 335 шт., 336 шт., 337 шт. 0,338 шт., 339 шт., 340 шт., 341 шт., 342 шт., 343 шт., 344 шт., 345 шт., 346 шт., 347 шт., 348 шт., 349 шт., 350 шт., 351 шт., 352 шт., 353 шт., 354 355 шт. 356 шт. 357 шт. 358 шт. 359 шт. 360 шт. 361 шт. 362 шт. 363 шт. 364 шт. 365 шт. 366 шт. 367 шт. 368 шт. 369 шт. 370 шт. 371 шт., 372 шт., 373 шт., 374 шт., 375 шт., 376 шт., 377 шт., 378 шт., 379 шт., 380 шт., 381 шт., 382 шт., 383 шт.384 шт., 385 шт., 386 шт., 387 шт., 388 шт., 389 шт., 390 шт., 391 шт., 392 шт., 393 шт., 394 шт., 395 шт., 396 шт., 397 шт., 398 шт., 399 шт., 400 шт. 401 шт. 402 шт. 403 шт. 404 шт. 405 шт. 406 шт. 407 шт. 408 шт. 409 шт., 410 шт., 411 шт. 418 шт., 419 шт., 420 шт., 421 шт., 422 шт., 423 шт., 424 шт., 425 шт., 426 шт., 427 шт., 428 шт., 429 шт., 430 шт., 431 шт., 432 шт., 433 шт. 434 шт., 435 шт., 436 шт., 437 шт., 438 шт., 439 шт., 440 шт., 441 шт., 442 шт., 443 шт., 444 шт., 445 шт., 446 шт.447 шт., 448 шт., 449 шт., 450 шт., 451 шт., 452 шт., 453 шт., 454 шт., 455 шт., 456 шт., 457 шт., 458 шт., 459 шт., 460 шт., 461 шт., 462 шт., 463 шт. 0,464 шт., 465 шт., 466 шт., 467 шт., 468 шт., 469 шт., 470 шт., 471 шт., 472 шт., 473 шт., 474 шт., 475 шт., 476 шт., 477 шт., 478 шт., 479 шт., 480 481 шт. 482 шт. 483 шт. 484 шт. 485 шт. 486 шт. 487 шт. 488 шт. 489 шт. 490 шт. 491 шт. 492 шт. 493 шт. 494 шт. 495 шт. 496 шт. 497 шт. 498 шт. 499 шт. 500 шт.

Викинг ГШ22 | Подключение устройств

Викинг ГШ22 Обзор

12 футов.Шланг подачи природного газа и быстроразъемный узел. Доступно на AppliancesConnection

Характеристики:

• Полный комплект для быстрого разъединения для подачи топлива на природный газ
• Узел шланга и соединителя предназначен только для использования на открытом воздухе с переносными приборами, которые можно перемещать для удобства эксплуатации
• Клапан в розетке автоматически обеспечивает полный поток газа, когда вилка подключена, и предотвращает поток газа, когда вилка отключена
• Включает быстроразъемную розетку с внутренней трубной резьбой, штекер и шланг в сборе, а также адаптер для соединения с внутренним фитингом на решетке (снимается для соединения шланга с охватываемым фитингом)

Викинг ГШ22 Технические характеристики

Модель

• Марка Викинг
• SKU ГШ22
• Stock Id 239699
• Номер продукта ГШ22
• Информация о гарантии Совершенно новый

  Совершенно новый товар с полной гарантией производителя

Технические данные

• Масса 3. 00
• Длина 12 ‘

Викинг ГШ22 Скидки

Пожалуйста, обрати внимание: Клиент несет исключительную ответственность за загрузку, заполнение и отправку скидки в течение отведенного периода времени.Обязательно следуйте всем инструкциям. AppliancesConnection не несет ответственности за отклоненные или не востребованные скидки.

Вам понадобится Adobe Acrobat Reader для просмотра и печати файлов PDF.

Баланс между антиоксидантным путем NRF2 / GSH и репарацией ДНК модулирует устойчивость к цисплатину в клетках рака легких

Повышенная гибель клеток после лечения цисплатином связана с более высокой индукцией повреждения ДНК

Чувствительность клеток к лечению цисплатином оценивалась на одном нормальном фибробласте легкого линия клеток (IMR-90) и две линии клеток NSCLC (A549 и NCI h33).Клетки инкубировали с возрастающими дозами цисплатина, и через 72 часа обработки измеряли жизнеспособность клеток. Как показано на фиг. 1A, клетки A549 были более устойчивы к обработке цисплатином, тогда как клеточная линия NCI h33 была наиболее чувствительной, причем клетки IMR-90 демонстрировали промежуточный фенотип. В соответствии с этим, клетки NCI h33 демонстрируют более высокие уровни индукции апоптоза по сравнению с клетками A549, на что указывает увеличение популяции суб-G1 (рис. 1B) и активация каспазы-3 (рис.1С).

Рисунок 1

Индукция гибели клеток и повреждения ДНК в нормальных и раковых клетках легких после воздействия цисплатина. ( A ) Кривая доза-ответ для трех линий клеток легких, обработанных увеличивающимися концентрациями цисплатина и проанализированных через 72 часа с использованием анализа XTT. ( B , C ) Апоптотическая фракция клеток легких, обработанных цисплатином в течение 72 часов, проанализирована как уровни популяции суб-G1 с использованием проточной цитометрии ядер, окрашенных PI, или кратного увеличения клеток с активной каспазой-3 относительно контролировать. (D) Проточно-цитометрический анализ положительного окрашивания γh3AX в клетках легких после обработки цисплатином (5 мкМ) в течение 6 и 24 часов. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех независимых экспериментов, * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.

Повреждение ДНК, вызванное обработкой цисплатином, может вызывать двухцепочечные разрывы (DSB) ДНК в процессе ее репликации или репарации. В свою очередь, DSB приводят к фосфорилированию гистона h3AX (γh3AX), который широко используется в качестве маркера генотоксического стресса.Анализ γh3AX-положительных клеток после обработки цисплатином показал, что клетки A549 имели низкую индукцию повреждения ДНК, тогда как линия NCI h33 имела высокую индукцию через 6 часов обработки и показывала трехкратное увеличение через 24 часа. Опять же, клеточная линия IMR-90 показала промежуточный фенотип со значительным увеличением окрашивания γh3AX только через 24 часа (рис. 1D и дополнительный рис. S1, где показаны репрезентативные графики проточной цитометрии). In situ иммунофлуоресценция для γh3AX также была проведена для.обработанные цисплатином клетки A549 и NCI h33, с явным увеличением очагов γh3AX в поврежденных клетках, особенно в клетках NCI h33 (дополнительный рисунок S2). Эти данные предполагают, что повышенная устойчивость опухолей к цисплатину может быть связана с более низкой индукцией повреждения ДНК.

Подавление XPF увеличивает индуцированную цисплатином гибель клеток

Поскольку большее количество повреждений ДНК, как показал анализ γh3AX, коррелирует с повышенной гибелью клеток, мы стремились выяснить, является ли повышенная способность репарации ДНК ответственна за фенотип устойчивости к цисплатину A549. Таким образом, белок-эндонуклеаза NER XPF подавлялась в клетках A549 (A549 shXPF) с использованием лентивирусной системы shRNA. Молчание приводит к существенному снижению уровней белка XPF и, что интересно, также уровней белка его гетеродимерного партнера ERCC1, указывая тем самым, что XPF необходим для поддержания стабильности ERCC1 и предотвращения его деградации (рис. 2A). Эти результаты согласуются с наблюдениями, что когда XPF отсутствует, ERCC1 накапливается в цитозоле и не перемещается в ядро ​​ ²² .Чтобы получить дополнительную информацию о роли репарации ДНК как фактора устойчивости к цисплатину, был проведен анализ реактивации клетки-хозяина (HCR). В этом анализе поврежденная плазмида, экспрессирующая репортерный ген флуоресцентного белка, трансфицируется в клетки, и восстановление флуоресценции определяется с помощью проточной цитометрии. На уровни флуоресценции напрямую влияет способность клеток к репарации ДНК. Анализ HCR показал, что клетки shXPF A549 теряют способность удалять УФ (рис. 2B) и поражения, вызванные цисплатином (рис.2С). Примечательно, что клетки с подавленным XPF проявляли большую чувствительность к обработке цисплатином, аналогичную жизнеспособности клеток, наблюдаемой для нормальной линии клеток, IMR-90, как показано анализом жизнеспособности клеток XTT и активацией каспазы-3 (рис. 2D и дополнительный рис. S3).

Рисунок 2

Нокдаун XPF и его влияние на жизнеспособность клеток после воздействия цисплатина. (A) Обнаружение XPF и ERCC1 и относительная количественная оценка вестерн-блоттингом в клетках A549 дикого типа или трансдуцированных лентивирусом shXPF.Полноразмерные мембраны показаны на дополнительном рисунке S6. (B , C) Анализ HCR с люциферазной плазмидой, облученной 600 Дж / м ² UVC или обработанной 750 нМ цисплатина, соответственно. (D) Кривая доза-ответ жизнеспособности линий клеток shXPF A549 или A549, обработанных увеличивающимися концентрациями цисплатина и проанализированных через 72 часа обработки с помощью анализа XTT. Значения представляют собой среднее ± SEM трех независимых экспериментов (два для экспериментов вестерн-блоттинг), * P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001.

Одной репарации ДНК недостаточно для определения устойчивости к цисплатину в клеточных линиях рака легкого.

Одним из механизмов, который может быть ответственным за разную степень повреждения ДНК среди клеточных линий, является внутриклеточное накопление цисплатина. Транспортный канал Купера (CTR1) является одним из основных механизмов захвата цисплатина клетками. Было замечено, что более низкая экспрессия CTR1 приводит к уменьшенному накоплению внутриклеточного цисплатина, уменьшая количество повреждений ДНК и придавая устойчивость к лечению ⁶ .Как показано на фиг. 3A, уровни экспрессии белка, обнаруженные с помощью вестерн-блоттинга, показали, что нет никакой разницы в количестве белка CTR1 среди трех исследованных клеточных линий, и, следовательно, степень повреждения ДНК и различия в чувствительности между ними не могут быть объяснены дифференциальное внутриклеточное накопление цисплатина.

Рисунок 3

Состояние CTR1 и способность к репарации ДНК в нормальных и раковых клетках легких. ( A , B) Анализ цельноклеточных лизатов рака легких человека на уровни белков CTR1, XPF и ERCC1, соответственно, вестерн-блоттингом.Полноразмерные мембраны показаны на дополнительном рисунке S6. (C , D) HCR-анализ линий клеток рака легких, трансфицированных люциферазной плазмидой, облученных 600 Дж / м ² UVC или обработанных 750 нМ цисплатина, соответственно. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех независимых экспериментов (два для экспериментов вестерн-блоттинг), * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.

Учитывая возможность того, что каждая клеточная линия получает разное количество отбрасываемого лекарства, мы сосредоточились на том, чтобы понять, может ли способность репарации ДНК, как показал нокдаун XPF в наиболее устойчивой линии, объяснить различную чувствительность к цисплатину среди них. Чтобы решить эту проблему, были исследованы уровни белков гетеродимерных партнеров XPF и ERCC1 (рис. 3B). Клеточная линия IMR-90 показала пониженную экспрессию обоих белков с уровнями, аналогичными клеткам shXPF A549, что могло бы объяснить ее пониженную жизнеспособность клеток. Однако неожиданно оказалось, что клеточная линия NCI h33, наиболее чувствительная к цисплатину, показала самые высокие уровни экспрессии этих белков репарации ДНК. Чтобы понять, снизилась ли способность к репарации ДНК, несмотря на высокие уровни белков XPF и ERCC1 в этих клетках из-за мутаций в тех или иных белках пути NER, что сделало его нефункциональным, был проведен анализ HCR.Примечательно, что было обнаружено, что нет различий между способностью к репарации как УФ-, так и цисплатин-индуцированных повреждений в клетках A549 и NCI h33, наиболее и наименее устойчивых клетках, соответственно (фиг. 3C, D). Следовательно, эти результаты показывают, что, хотя репарация ДНК является важным механизмом, другие механизмы могут играть основную роль в определении устойчивости к цисплатину, особенно в клеточной линии NCI h33.

NRF2 / глутатион-опосредованный путь антиоксидантной защиты влияет на устойчивость к цисплатину

Еще одним фактором, который может объяснить различную чувствительность между клеточными линиями A549 и NCI h33, является повышенная детоксикация цисплатина, которая может уменьшить повреждение ДНК цисплатина и, как следствие, более низкую цитотоксичность лекарства .Хорошо известно, что одним из основных факторов, способствующих внутриклеточной детоксикации цисплатина, является GSH, поскольку он может ковалентно связываться с лекарством и предотвращать его попадание в ДНК. Действительно, количественная оценка внутриклеточного соотношения между восстановленным и окисленным GSH, показателем внутриклеточного количества полезного GSH, показала, что A549 демонстрирует более высокое соотношение, что указывает на более высокие уровни восстановленного GSH и, следовательно, показывает обратную корреляцию с количеством индуцированных повреждений ДНК. цисплатином в обеих клеточных линиях (рис.4А). Чтобы подтвердить, что уровни GSH могут влиять на чувствительность к цисплатину, клеточную линию A549 инкубировали с BSO (бутионин сульфоксимин) — хорошо известным ингибитором y-глутамилцистеинсинтетазы, необходимого фермента для синтеза GSH — и затем обрабатывали цисплатином. Сам по себе BSO не приводил к снижению жизнеспособности клеток, однако при использовании в сочетании с цисплатином он сенсибилизировал клеточную линию, что приводило к значительному снижению жизнеспособности клеток по сравнению с одним цисплатином (рис. 4B и дополнительный рис.S3).

Рисунок 4

Профиль продукции глутатиона и экспрессия NRF2 в клетках рака легких и влияние на устойчивость к цисплатину. ( A) Количественная оценка базального внутриклеточного отношения GSH / GSSG в клеточных линиях рака легких. (B) Жизнеспособность клеток, определенная с помощью анализа XTT, в клетках A549, обработанных цисплатином (5 мкМ) и BSO (500 мкМ) в течение 72 часов. (C) Количественная оценка экспрессии мРНК GCLM и xCT в клетках рака легких на базовых уровнях с помощью ПЦР в реальном времени, нормализованной по экспрессии GAPDH. (D) Определение уровня белка NRF2 и относительная количественная оценка вестерн-блоттингом в клетках рака легких. Полноразмерные мембраны показаны на дополнительном рис. S7. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех независимых экспериментов (два для экспериментов вестерн-блоттинг), * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.

Стремление исследовать источник разницы в уровнях GSH между обеими линиями клеток рака легкого, экспрессию GCLM (фермент, ответственный за синтез GSH) и xCT (субъединица антипортера, который экспортирует глутамат, импортируя цистеин для синтеза глутатиона) оценивали с помощью ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР).Результаты показывают, что уровни мРНК обоих генов значительно снижены в клеточной линии NCI h33, что может объяснить пониженные уровни GSH, наблюдаемые в этой клеточной линии (фиг. 4C). Важно отметить, что экспрессия этих генов контролируется фактором транскрипции NRF2, и, фактически, уровень этого белка был сильно снижен в наиболее чувствительной клеточной линии NCI h33, что объясняет снижение экспрессии генов, участвующих в синтезе GSH (рис. . 4D). In situ иммунофлуоресценция NRF2 также показала, что этот белок высоко экспрессируется и присутствует в ядре клеток A549 с меньшей экспрессией в ядре клеток h33 (репрезентативные результаты показаны на дополнительном рис.S4). Экспрессия мРНК других классических генов-мишеней NRF2 также была исследована с помощью ОТ-ПЦР: гемоксигеназа 1 (HO1) и NAD (P) H хинондегидрогеназа 1 (NQO1), а также ферменты, связанные с утилизацией глутатиона, такие как глутатионпероксидазы 1, 2 и 3 (GPx1, GPx2 и GPx3), причем все они имеют пониженную экспрессию в NCI h33 по сравнению с клетками A549 (дополнительный рисунок S5).

Сверхэкспрессия NRF2 вызывает устойчивость к цисплатину

На основании этих результатов мы предположили, что уровни фактора транскрипции NRF2 могут определять чувствительность к цисплатину в клеточных линиях рака легких путем регулирования продукции GSH.Для проверки этой гипотезы были созданы линии клеток с нокдауном A549 NRF2 (A549 shNRF2) и NCI h33 NRF2 со сверхэкспрессией (h33 NRF2). Как показано на фиг. 5A, наблюдалось существенное снижение уровней белка NRF2 в линии клеток A549 shNRF2, в то время как сверхэкспрессия была способна повышать количество фактора транскрипции в клетках h33 NRF2 до уровней, сравнимых с клетками A549. Важно отметить, что значительное снижение и увеличение пониженных уровней GSH наблюдалось в клеточных линиях с нокдауном и сверхэкспрессией NRF2, соответственно (рис.5Б).

Фиг. 5

Клеточный ответ подавленных или сверхэкспрессированных NRF2 клеток на лечение цисплатином. (A) Определение уровня белка NRF2 и относительная количественная оценка с помощью вестерн-блоттинга в клетках A549, родительских или трансдуцированных лентивирусным рекомбинантным вектором shNRF2 (A549 shNRF2), и клетках h33, родительских или трансдуцированных рекомбинантным вектором лентивируса со сверхэкспрессией NRF2 (h33 NRF2). Полноразмерные мембраны показаны на дополнительном рис. S7. (B) Количественная оценка базального внутриклеточного восстановленного глутатиона в различных клеточных линиях (C , D) Кривые доза-ответ для клеток A549 и A549 shNRF2 ( C ) и h33 и h33 NRF2 ( D ) клетки линии, обработанные увеличивающимися концентрациями цисплатина и проанализированные через 72 часа обработки с помощью анализа XTT.Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех независимых экспериментов (два для экспериментов вестерн-блоттинг), * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.

Примечательно и подтверждая нашу гипотезу, A549 shNRF2 показал более высокую чувствительность к лечению цисплатином, как показывает анализ жизнеспособности клеток XTT (фиг. 5C). Напротив, сверхэкспрессия NRF2 в клетках NCI h33 в значительной степени индуцировала устойчивость к лечению цисплатином с почти 3-кратным увеличением жизнеспособности клеток при низких дозах (фиг. 5D). Также была проведена активация каспазы, и данные полностью подтвердили эти наблюдения с более высокой чувствительностью для A549 shNRF2 и повышенной устойчивостью к клеточным линиям h33 NRF2 (дополнительный рис.S3).

Баланс экспрессии NRF2-KEAP1 изменяет прогноз пациентов с раком легких

Основываясь на доказательствах того, что NRF2 и GSH являются детерминантами устойчивости к цисплатину в культуре клеток линий рака легких, мы стремились исследовать, отражается ли это на прогнозе пациентов поставлен диагноз немелкоклеточный рак легкого. С этой целью мы проанализировали данные по экспрессии генов из TCGA для NRF2 и его ингибитора KEAP1, обнаружив, что между ними существует сильная положительная корреляция (рис.6А). Однако есть небольшая группа пациентов, которые не подчиняются этому шаблону, демонстрируя медианную экспрессию NRF2 и низкую экспрессию KEAP1 — красные точки (изменение NRF2-KEAP1), что указывает на более высокую активность фактора транскрипции в этих опухолях. Интересно, что общая выживаемость этой подгруппы пациентов по сравнению с остальными показывает, что они имеют значительно меньшую выживаемость (рис. 6В). Важно отметить, что у пациентов с опухолями с изменением NRF2-KEAP1 наблюдалось значительное увеличение экспрессии генов-мишеней NRF2, таких как NQO1, и ферментов, ответственных за синтез GSH, GCLC и GCLM, что указывает на то, что уровни GSH также выше (рис. .6С). Эти данные подтверждают наш анализ in vitro , поскольку, как мы показали, более высокое количество NRF2 и GSH опосредует устойчивость опухоли к лечению цисплатином, что в конечном итоге приводит к худшему прогнозу для пациентов с раком легких.

Рисунок 6

Баланс экспрессии NRF2-KEAP1 влияет на общую выживаемость у пациентов с немелкоклеточной карциномой легкого. ( A) Анализ RNAseq экспрессии NRF2 и KEAP1 в 1017 образцах немелкоклеточной карциномы легкого TCGA. Значения экспрессии оценивали с использованием RSEM, нормализованного верхнего квартиля, преобразования log2 (x + 1) и z-нормализации.Корреляция экспрессии рассчитывалась с использованием метода Пирсона. (B) Кривые выживаемости Каплана-Мейера пациентов, разделенные в соответствии с балансом экспрессии NRF2-KEAP1. Сравнения проводились с использованием лог-рангового теста. (C) Экспрессия генов-мишеней NRF2 в образцах, разделенных в соответствии с балансом экспрессии NRF2-KEAP1. Прямоугольники простираются от 25-го до 75-го процентиля, центральная жирная линия показывает медианное значение, а усы нанесены от минимального до максимального значений в пределах 1.5 межквартильный размах. Сравнения проводились с использованием t-критерия Стьюдента. *** p <0,001 и ** p <0,01 по сравнению с нормальной группой.

Gsh-1-зависимая регуляция промотора гена GHRH крысы, зависимая от белка GHRH | Молекулярная эндокринология

Аннотация

Хотя известно, что GHRH играет ключевую роль в регуляции оси GHRH-GH-IGF-I, молекулярный механизм экспрессии гена GHRH еще не исследован. Здесь мы изучали регуляцию транскрипции 5′-промотора гена GHRH, используя экспериментальную модельную систему in vitro.Мы особенно сосредоточили внимание на роли гомеобокса транскрипционного фактора Gsh-1, потому что у мышей с нокаутом Gsh-1 наблюдали карликовый фенотип и отмену экспрессии GHRH. Сначала мы клонировали Gsh-1 человека, который показал 87,3% гомологии с Gsh-1 мыши на уровне нуклеотидов. Когда 5′-промоторная область гена GHRH крысы была введена в линию плацентарных клеток человека JEG-3, в которой мы обнаружили эндогенную экспрессию Gsh-1, а также мРНК GHRH, была обнаружена значительная транскрипционная активность промотора.Активность промотора дополнительно усиливалась сверхэкспрессией белка Gsh-1, тогда как она существенно снижалась за счет устранения сайтов связывания Gsh-1. EMSA подтвердил фактическое связывание Gsh-1 на множественных сайтах связывания промотора гена GHRH. Наконец, коэкспрессия CREB-связывающего белка значительно усиливала экспрессию гена GHRH, индуцированную Gsh-1, что указывает на кооперативную роль белка-коактиватора. Поскольку обнаружено, что Gsh-1 экспрессируется в гипоталамусе взрослой крысы, наши данные свидетельствуют о том, что гомеобоксный белок Gsh-1 играет ключевую роль в экспрессии гена GHRH.

СОМАТИЧЕСКИЙ РОСТ В организме млекопитающих контролируется сложной регуляторной системой, которая берет свое начало в гипоталамусе, из которого высвобождаются два пептида, важные для регуляции соматотрофных клеток гипофиза: GHRH и соматостатин (1). Из них GHRH способствует секреции GH из гипофиза, что, в свою очередь, увеличивает производство IGF-I в печени или других тканях, опосредуя различные соматические и / или метаболические эффекты GH (2). Таким образом, GHRH является ключевым регуляторным фактором в положительном контроле функции оси GH-IGF-I.GHRH также играет важную роль в правильной пролиферации и дифференцировке соматотрофа через развитие гипофиза (3).

GHRH был впервые выделен из опухолей поджелудочной железы человека (4, 5), и с тех пор были проведены интенсивные физиологические исследования этого гормона. Его кДНК и ген также были клонированы у разных видов (6–8). Тем не менее, практически не было исследований, пытающихся выяснить транскрипционную регуляцию экспрессии гена GHRH.Частично это может быть связано с отсутствием подходящих клеток-хозяев, которые позволили бы экспрессировать промотор гена GHRH. Однако недавно появилось сообщение о том, что генетическое удаление гена гомеобокса Gsh-1 показало карликовый фенотип у мышей, при котором не сообщалось об экспрессии гена GHRH в дугообразном ядре гипоталамуса (9, 10). Это повышает вероятность того, что Gsh-1 является незаменимым транскрипционным фактором для тканеспецифической экспрессии гена GHRH, и эти клетки, экспрессирующие Gsh-1, могут быть адекватными для изучения экспрессии гена GRH.

В этом исследовании мы сначала исследовали регуляцию транскрипции гена GHRH, используя линию плацентарных клеток человека JEG-3. Мы обнаружили, что в клетках экспрессируется эндогенная мРНК Gsh-1, а также мРНК GHRH, и что при введении слитого гена 5′-промотор GHRH-люцифераза наблюдался значительный уровень активности промотора гена GHRH. Кроме того, мы получили доказательства, показывающие, что Gsh-1 действительно является ключевым фактором транскрипции для поддержания экспрессии гена GHRH.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клонирование кДНК человеческого Gsh-1

Сначала мы клонировали гомолог кДНК Gsh-1 человека.Путем скрининга библиотеки кДНК мозга плода человека с использованием мышиного гена Gsh-1 в качестве зонда мы выделили клон кДНК человеческого Gsh-1. Когда полученные последовательности сравнивали с кДНК мыши, наблюдалась гомология 87,3% и 96,6% на уровне нуклеотидов и белков, соответственно (рис. 1, A и B; инвентарные номера GenBank AB044157 и AB044158 для кДНК Gsh-1 человека и ген). Структуры генов (два экзона и один интрон) также были сходными у мыши и человека (данные не показаны), что указывает на то, что гомеобоксный белок Gsh-1 является высококонсервативным транскрипционным фактором среди видов.

Рисунок 1.

Сравнение последовательностей кДНК Gsh-1 мыши и человека и белков А, выравнивание кДНК Gsh-1 человека и мыши. Цифры в правом столбце соответствуют нуклеотидным остаткам. Звездочки указывают остатки, идентичные человеческому Gsh-1. B. Выравнивание предсказанных белковых последовательностей Gsh-1 человека и мыши. Цифры в правом столбце соответствуют аминокислотным остаткам. Звездочки указывают остатки, идентичные человеческому Gsh-1.

Рисунок 1.

Сравнение последовательностей кДНК Gsh-1 мыши и человека и белков А, выравнивание кДНК Gsh-1 человека и мыши. Цифры в правом столбце соответствуют нуклеотидным остаткам. Звездочки указывают остатки, идентичные человеческому Gsh-1. B. Выравнивание предсказанных белковых последовательностей Gsh-1 человека и мыши. Цифры в правом столбце соответствуют аминокислотным остаткам. Звездочки указывают остатки, идентичные человеческому Gsh-1.

Анализ экспрессии мРНК GHRH и Gsh-1

Затем мы проверили экспрессию мРНК Gsh-1 и GHRH с помощью ОТ-ПЦР в различных линиях эндокринных клеток и в тканях взрослых крыс. Мы обнаружили, что обе мРНК коэкспрессируются в линии плацентарных клеток человека JEG-3 (фиг. 2A), а также в гипоталамусе (фиг. 2B) и семенниках (не показаны на рисунке). Хотя экспрессия Gsh-1 была обнаружена в некоторых других клеточных линиях и тканях без экспрессии GHRH, мы не смогли увидеть мРНК GHRH без экспрессии Gsh-1 (Таблица 1).Эти результаты предполагают, что ген гомеобокса Gsh-1 экспрессируется как в тканях взрослых, так и в тканях плода, и что присутствие Gsh-1 необходимо, хотя и недостаточно, для экспрессии GHRH. Кроме того, внутренняя экспрессия как Gsh-1, так и GHRH в клетках JEG-3 предполагает, что линия клеток подходит для изучения регуляции транскрипции гена GHRH.

Рисунок 2.

Экспрессия мРНК Gsh-1 и GHRH в линии плацентарных клеток человека JEG-3 и гипоталамусе крысы, проанализированных с помощью ОТ-ПЦР А. Амплифицированные фрагменты ДНК с предсказанной длиной (381 п.н. и 331 п.н. для человека МРНК Gsh-1 и GHRH соответственно), полученная из клеток JEG-3 с использованием специфических наборов праймеров для человеческого Gsh-1 и GHRH.В. Амплифицированные фрагменты ДНК с предсказанной длиной (381 п.н. и 214 п.н. для мРНК Gsh-1 и GHRH крысы соответственно), полученные из гипоталамических тканей взрослой крысы с использованием специфических наборов праймеров для Gsh-1 и GHRH крысы. M относится к маркерам ДНК. Контрольные реакции без RT не показали амплификаций (данные не показаны).

Рисунок 2.

Экспрессия мРНК Gsh-1 и GHRH в линии плацентарных клеток человека JEG-3 и гипоталамусе крысы, проанализированных с помощью ОТ-ПЦР A. Амплифицированные фрагменты ДНК с предсказанной длиной (381 п.н. и 331 п.н. для мРНК человеческого Gsh-1 и GHRH соответственно), полученная из клеток JEG-3 с использованием специфических наборов праймеров для человеческого Gsh-1 и GHRH.В. Амплифицированные фрагменты ДНК с предсказанной длиной (381 п.н. и 214 п.н. для мРНК Gsh-1 и GHRH крысы соответственно), полученные из гипоталамических тканей взрослой крысы с использованием специфических наборов праймеров для Gsh-1 и GHRH крысы. M относится к маркерам ДНК. Контрольные реакции без RT не показали амплификаций (данные не показаны).

Таблица 1. Анализ

ОТ-ПЦР экспрессии мРНК GRH и Gsh-1

—

.	Гш-1 .	GRH .
Ткани
Кора головного мозга	—	—
Церебеллум									+	—
Сердце	—	—
Желудок	—	—
Двуоденовая кишка	—	—
Толстая кишка	+	—
Поджелудочная железа	+	—
Печень	—					—	—
Яичко	+	+
Клеточные линии
AtT20	+	—
GH									+	+
LI a	—	—
MtT / S b	—	—
	Gsh — / — c	—	—
Gsh + / + c	+	—

—

.	Гш-1 .	GRH .
Ткани
Кора головного мозга	—	—
Церебеллум									+	—
Сердце	—	—
Желудок	—	—
Двуоденовая кишка	—	—
Толстая кишка	+	—
Поджелудочная железа	+	—
Печень	—					—	—
Яичко	+	+
Клеточные линии
AtT20	+	—
GH									+	+
LI a	—	—
MtT / S b	—	—
	Gsh — / — c	—	—
Gsh + / + c	+	—

Таблица 1.

Анализ экспрессии мРНК GRH и Gsh-1 с помощью ОТ-ПЦР

—

.	Гш-1 .	GRH .
Ткани
Кора головного мозга	—	—
Церебеллум									+	—
Сердце	—	—
Желудок	—	—
Двуоденовая кишка	—	—
Толстая кишка	+	—
Поджелудочная железа	+	—
Печень	—					—	—
Яичко	+	+
Клеточные линии
AtT20	+	—
GH									+	+
LI a	—	—
MtT / S b	—	—
	Gsh — / — c	—	—
Gsh + / + c	+	—

—

.	Гш-1 .	GRH .
Ткани
Кора головного мозга	—	—
Церебеллум									+	—
Сердце	—	—
Желудок	—	—
Двуоденовая кишка	—	—
Толстая кишка	+	—
Поджелудочная железа	+	—
Печень	—					—	—
Яичко	+	+
Линии клеток
AtT20	+	—
GH									+	+
LI a	—	—
MtT / S b	—	—
	Gsh — / — c	—	—
Gsh + / + c	+	—

Транскрипционная активность 5′-промотора гена GHRH или нейрохирургического агента в JEG Линии клеток, экспрессирующие Gsh-1

Когда 5′-промотор гена GHRH крысы (от -472 до +71; +1 обозначает сайт начала гипоталамической транскрипции) -ген слияния гена люциферазы был введен в клетки JEG-3, наблюдалась значительная активность промотора по сравнению с активностью промотора без промотора. плазмида (рис.3А). Чтобы подтвердить, может ли активность промотора быть связана с присутствием Gsh-1, мы исследовали экспрессию промотора в линиях клеток-предшественников гипоталамуса мыши с Gsh-1 или без него (Gsh + / + и Gsh — / -; любезно предоставлены Dr Поттер) (14). Линия клеток Gsh + / +, которая внутренне экспрессирует Gsh-1, была получена из гипоталамуса мышей, трансгенных по Т-антигену Gsh-1-SV40, а линия клеток Gsh — / -, в которой отсутствует Gsh-1, была получена из гипоталамус мышей с нокаутом Gsh-1 (14). Опять же, активность промотора гена GHRH была более чем в 4 раза выше в клетках Gsh + / +, чем в клетках Gsh — / — (рис.3Б). Кроме того, когда белок Gsh-1 коэкспрессировался с GHRH в клетках JEG-3, активность промотора дополнительно усиливалась дозозависимым образом (фиг. 4). В целом, наши данные убедительно свидетельствуют о том, что гомеобоксный белок Gsh-1 играет ключевую роль в экспрессии гена GHRH.

Рисунок 3.

Gsh-1-зависимая экспрессия 5′-промотора A гена GHRH, клетки JEG-3 трансфицировали GRH ₄₇₂ Luc или беспромоторной плазмидой (pA3Luc), и активность промотора определяли с помощью люциферазы. проба.*, P <0,01 по сравнению с . плазмида без промотора. Клетки B, Gsh-1 + / + и Gsh-1 — / — трансфицировали GRH ₄₇₂ Luc, и активность промоторов определяли с помощью люциферазного анализа. *, P <0,001 по сравнению с . Гш-1 — / — ячеек. В обоих экспериментах вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля.

Фигура 3.

Gsh-1-зависимая экспрессия 5′-промотора A гена GHRH, клетки JEG-3 трансфицировали GRH ₄₇₂ Luc или плазмидой без промотора (pA3Luc), и активность промотора определяли с помощью люциферазный анализ.*, P <0,01 по сравнению с . плазмида без промотора. Клетки B, Gsh-1 + / + и Gsh-1 — / — трансфицировали GRH ₄₇₂ Luc, и активность промоторов определяли с помощью люциферазного анализа. *, P <0,001 по сравнению с . Гш-1 — / — ячеек. В обоих экспериментах вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля.

Рисунок 4.

Дозозависимый эффект сверхэкспрессии Gsh-1 на 5′-промотор гена GHRH в клетках JEG-3 Клетки JEG-3 трансфицировали GRH ₄₇₂ Luc и различными количествами вектора экспрессии Gsh-1. и активности 5′-промотора GHRH определяли с помощью люциферазного анализа.*, P <0,05 по сравнению с . контрольная группа (В) без коэкспрессии Gsh-1. В обоих экспериментах вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля.

Рисунок 4.

Дозозависимый эффект сверхэкспрессии Gsh-1 на 5′-промотор гена GHRH в клетках JEG-3 Клетки JEG-3 трансфицировали GRH ₄₇₂ Luc и различными количествами экспрессии Gsh-1. вектора, и активность 5′-промотора GHRH определяли с помощью люциферазного анализа. *, P <0.05 и . контрольная группа (В) без коэкспрессии Gsh-1. В обоих экспериментах вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля.

Связывание белка Gsh-1 с 5′-промоторной областью GHRH

Анализ нуклеотидных последовательностей 5′-промоторной области гена GHRH выявил пять предполагаемых сайтов связывания Gsh-1 [консенсусная последовательность: GC ^T / _C ^A / _C ATTA ^G / _A ] (9) (см. Пояснение к рис.5). Чтобы увидеть, связывается ли белок Gsh-1 с некоторыми или со всеми последовательностями, мы провели EMSA с использованием слитого белка глутатион- S -трансфераза (GST) -Gsh-1. Как показано на фиг. 5, комплекс ДНК-белок наблюдался, когда белок Gsh-1 обрабатывали фрагментами ДНК, содержащими четыре (G2-G5) из пяти проанализированных последовательностей (дорожки 3, 6, 9 и 14). Не было получено связывания с белком GST без Gsh-1 (дорожки 2, 5, 8 и 13). Все объекты сдвига геля, образованные слитым белком GST-Gsh-1, антагонизировались при инкубации со 100-молярным избытком каждого немеченого фрагмента ДНК, но не с мутированной последовательностью (M).Кроме того, ³² P-меченный зонд M не смог связываться с GST-Gsh-1 (дорожка 12). Добавление антитела к Myc-tag вызывало сверхсдвиг и / или смещение, подтверждая специфичность. В целом эти данные предполагают, что Gsh-1 действительно связывается по крайней мере с четырьмя сайтами в 5′-промоторной области гена GHRH.

Рисунок 5.

Анализ связывания

белка Gsh-1 с областью 5′-промотора гена A GHRH крысы, локализация сайтов связывания Gsh-1 в 5′-промоторе GHRH крысы.Последовательности в рамке указывают предполагаемые связывающие элементы на основе консенсусной последовательности Gsh-1 (GC ^T / _C ^A / _C ATTA ^G / _A ) (9). Последовательности под каждым прямоугольником представляют собой мутированные последовательности, используемые в EMSA или в анализе промоторов (фиг. 6). B — EMSA сайтов связывания Gsh-1. На левой панели ³² Р-меченные фрагменты, охватывающие примерно 20 п.н. каждого сайта связывания Gsh-1, инкубировали с GST (дорожки 2, 5, 8 и 13) или слитым белком GST-Gsh-1 ( дорожки 1, 3, 4, 6, 7, 9–12 и 14–23).Мутировавший зонд G4 (M) использовали в дорожках 11 и 12. Немеченые фрагменты использовали в качестве конкурента (дорожки 4, 7, 10 и 15). На правой панели каждую реакционную смесь инкубировали еще 60 мин с антителом против Myc tag (дорожки 17, 19, 21 и 23).

Рисунок 5.

Анализ связывания белка Gsh-1 с областью 5′-промотора гена A GHRH крысы, локализация сайтов связывания Gsh-1 в 5′-промоторе GHRH крысы. Последовательности в рамке указывают предполагаемые связывающие элементы на основе консенсусной последовательности Gsh-1 (GC ^T / _C ^A / _C ATTA ^G / _A ) (9). Последовательности под каждым прямоугольником представляют собой мутированные последовательности, используемые в EMSA или в анализе промоторов (фиг. 6). B — EMSA сайтов связывания Gsh-1. На левой панели ³² Р-меченные фрагменты, охватывающие примерно 20 п.н. каждого сайта связывания Gsh-1, инкубировали с GST (дорожки 2, 5, 8 и 13) или слитым белком GST-Gsh-1 ( дорожки 1, 3, 4, 6, 7, 9–12 и 14–23). Мутировавший зонд G4 (M) использовали в дорожках 11 и 12. Немеченые фрагменты использовали в качестве конкурента (дорожки 4, 7, 10 и 15).На правой панели каждую реакционную смесь инкубировали еще 60 мин с антителом против Myc tag (дорожки 17, 19, 21 и 23).

Анализ делеции / мутации сайтов связывания Gsh-1 промотора гена GHRH

Чтобы подтвердить, что некоторые или все сайты связывания Gsh-1 являются функциональными, транскрипционная активность удаленного или мутированного промотора была проанализирована в клетках JEG-3. Как показано на фиг. 6A, активность промотора GHRH значительно снизилась, когда все сайты связывания Gsh-1 были устранены (GRH ₄₇ Luc), тогда как делеция G1 в G4 не имела никакого эффекта.Более того, введение мутации в индивидуальный сайт связывания (mG1-mG5) не вызывает никакого эффекта (рис. 6B), тогда как активность промотора резко снижается, когда все сайты связывания мутируют (mG1-5) (рис. 6C). Эти результаты предполагают, что альтернативное связывание одного или нескольких белков Gsh-1 способствует поддержанию транскрипционной активности гена GHRH.

Рис. 6.

Анализ делеции / мутации промотора гена GHRH A, клетки JEG-3 трансфицировали полноразмерными (GRH ₄₇₂ Luc) или удаленными конструкциями промотора (GRH ₃₀₄ Luc, GRH ₂₄₇ Luc. , GRH ₁₈₇ Luc, GRH ₁₃₃ Luc, GRH ₄₇ Luc) с постоянным количеством вектора экспрессии Gsh-1 (RSV-Gsh-1).G1-G5 представляет собой предполагаемые сайты связывания Gsh-1. *, P <0,05 по сравнению с . GRH ₄₇₂ Люк. B, клетки JEG-3 трансфицировали конструкцией полной длины (GRH ₄₇₂ Luc) или конструкциями, мутировавшими в каждом из сайтов связывания Gsh-1 (mG1, mG2, mG3, mG4 и mG5) с постоянным количеством РСВ-Гш-1. X представляет собой мутированные сайты. C, JEG-3 клетки трансфицировали конструкцией дикого типа (GRH ₄₇₂ Luc) или мутантной конструкцией, в которой все предполагаемые сайты связывания Gsh-1 были мутированы (mG1-5).*, P <0,001 по сравнению с . GRH ₄₇₂ Люк. Во всех экспериментах вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля.

Рисунок 6.

Анализ делеции / мутации промотора гена GHRH A, клетки JEG-3 трансфицировали полноразмерными (GRH ₄₇₂ Luc) или удаленными конструкциями промотора (GRH ₃₀₄ Luc, GRH ₂₄₇ Luc, GRH ₁₈₇ Luc, GRH ₁₃₃ Luc, GRH ₄₇ Luc) с постоянным количеством вектора экспрессии Gsh-1 (RSV-Gsh-1).G1-G5 представляет собой предполагаемые сайты связывания Gsh-1. *, P <0,05 по сравнению с . GRH ₄₇₂ Люк. B, клетки JEG-3 трансфицировали конструкцией полной длины (GRH ₄₇₂ Luc) или конструкциями, мутировавшими в каждом из сайтов связывания Gsh-1 (mG1, mG2, mG3, mG4 и mG5) с постоянным количеством РСВ-Гш-1. X представляет собой мутированные сайты. C, JEG-3 клетки трансфицировали конструкцией дикого типа (GRH ₄₇₂ Luc) или мутантной конструкцией, в которой все предполагаемые сайты связывания Gsh-1 были мутированы (mG1-5).*, P <0,001 по сравнению с . GRH ₄₇₂ Люк. Во всех экспериментах вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля.

Функциональное взаимодействие Gsh-1 с CREB-связывающим белком в регуляции гена GHRH

Наконец, мы исследовали, действует ли Gsh-1 за счет взаимодействия с некоторыми др. Факторами транскрипции или кофактором (ами). В частности, мы сосредоточились на коактиваторном белке CBP, поскольку было показано, что некоторые из факторов транскрипции, определяющих тканеспецифическую экспрессию (например, Pit-1), взаимодействуют с CBP (15).Мы снова обнаружили, что экспрессия Gsh-1 заметно усиливает промоторную активность GHRH. Кроме того, коэкспрессия CBP значительно усиливала эффект Gsh-1, хотя экспрессия только CBP не имела эффекта (фиг. 7A). В конструкции mG1-5, в которой все сайты связывания Gsh-1 мутированы, CBP также не оказывает усиливающего эффекта, указывая тем самым, что связывание Gsh-1 необходимо для синергизма Gsh-1 / CBP (Fig. 7B). Кроме того, когда каждый отдельный сайт связывания Gsh-1 (G2-G5) был расположен в гетерологичном промоторе (минимальный промотор тимидинкиназы), синергетического эффекта Gsh-1 и CBP не наблюдалось (рис.8).

Рисунок 7.

Синергическая активация Gsh-1 и CBP на промоторе гена GHRH A, клетки JEG-3 котрансфицировали GRH ₄₇₂ Luc и векторами экспрессии Gsh-1 и / или CBP, а также GHRH 5 ‘ -промоторные активности определяли с помощью люциферазного анализа. B, клетки JEG-3 котрансфицировали конструкцией mG1-5 и векторами экспрессии Gsh-1 и / или CBP, и активность 5’-промотора GHRH определяли с помощью люциферазного анализа. Вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля.*, P <0,01 по сравнению с . GRH ₄₇₂ Люк один. **, P <0,05 по сравнению с . GRH ₄₇₂ Люк + Gsh-1.

Рисунок 7.

Синергетическая активация Gsh-1 и CBP на промоторе гена GHRH A, клетки JEG-3 котрансфицировали GRH ₄₇₂ Luc и векторами экспрессии Gsh-1 и / или CBP, а также GHRH 5 Активность ‘-промотора определяли с помощью анализа люциферазы. B, клетки JEG-3 котрансфицировали конструкцией mG1-5 и векторами экспрессии Gsh-1 и / или CBP, и активность 5’-промотора GHRH определяли с помощью люциферазного анализа. Вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля. *, P <0,01 по сравнению с . GRH ₄₇₂ Люк один. **, P <0,05 по сравнению с . GRH ₄₇₂ Люк + Gsh-1.

Рисунок 8.

Эффекты коэкспрессии Gsh-1 / CBP в конструкциях Gsh-TK-Luc A, Структура конструкции Gsh-TK-Luc. Каждый сайт связывания Gsh-1 (G2-G5) в 5′-промоторе GHRH был изолирован и расположен перед минимальным промотором гена люциферазы TK.B, клетки JEG-3 котрансфицировали каждой конструкцией Gsh-TK-Luc и векторами экспрессии Gsh-1 и / или CBP, и активности промоторов определяли с помощью анализа люциферазы. Вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля. *, P <0,05 по сравнению с . каждое действие Gsh-TK-Luc без CBP / Gsh-1.

Рисунок 8.

Эффекты коэкспрессии Gsh-1 / CBP в конструкциях Gsh-TK-Luc A, Структура конструкции Gsh-TK-Luc. Каждый сайт связывания Gsh-1 (G2-G5) в 5′-промоторе GHRH был изолирован и расположен перед минимальным промотором гена люциферазы TK.B, клетки JEG-3 котрансфицировали каждой конструкцией Gsh-TK-Luc и векторами экспрессии Gsh-1 и / или CBP, и активности промоторов определяли с помощью анализа люциферазы. Вектор экспрессии β-галактозидазы использовали в качестве внутреннего контроля. *, P <0,05 по сравнению с . каждое действие Gsh-TK-Luc без CBP / Gsh-1.

ОБСУЖДЕНИЕ

Хотя с момента клонирования гена GHRH с его промоторной областью прошло более 10 лет (6, 7), практически не появилось сообщений о его регуляции транскрипции GHRH.Фактически, предыдущие усилия были затруднены в основном из-за отсутствия гомологичной клеточной линии, которая была бы подходящей для изучения тканеспецифической регуляции гена GHRH. Однако недавние открытия фактора транскрипции Gsh-1 типа гомеобокса (9, 10) побудили нас искать подходящие клетки-хозяева, экспрессирующие ген гомеобокса, и мы наконец обнаружили, что промотор гена GHRH хорошо экспрессируется в некоторых плацентарных и линии нейрональных клеток, в которых эндогенно экспрессируется Gsh-1.

Тканевая специфичность экспрессии генов гормонов гипоталамуса или гипофиза во многих случаях определяется наличием определенных факторов транскрипции.Например, экспрессия генов GH, PRL и TSH в значительной степени зависит от фактора транскрипции домена PIT-1 (16–18), а CRH и вазопрессина — от гомеобоксового белка Brain-2 (19, 20). Что касается GHRH, работа Potter и соавторов (9, 10) с использованием методов гомологичной рекомбинации убедительно свидетельствует о том, что Gsh-1 является ключевым детерминантом экспрессии гена GHRH. Наши данные, полученные в этом исследовании, подтверждают это мнение, показывая, что Gsh-1 является необходимым условием для поддержания транскрипционной активности гена GHRH.Действительно, активность промотора хорошо сохранялась в линиях гипоталамических клеток JEG-3 и Gsh + / +, обе из которых экспрессируют Gsh-1 (14), тогда как в линии клеток Gsh — / — наблюдалась гораздо меньшая активность. Сверхэкспрессия Gsh-1 в JEG-3 дополнительно усиливала активность промотора, указывая на зависимость экспрессии гена GHRH от белка гомеобокса. Более того, анализ RT-PCR показал, что экспрессия мРНК Gsh-1 присутствует в любой клеточной линии или ткани, которые экспрессируют мРНК GHRH. С другой стороны, экспрессия Gsh-1 не всегда сопровождается экспрессией GHRH, и, фактически, кратковременная экспрессия одного только Gsh-1 не спасает промоторную активность гена GHRH в Gsh — / — или других клетках. линии (данные не показаны).Мы предполагаем, что некоторые дополнительные зависимые от Gsh-1 транскрипционные факторы также необходимы для поддержания экспрессии гена GHRH.

В исследованной нами области 5′-промотора гена GHRH пять предполагаемых сайтов связывания Gsh-1 были распознаны с помощью метода поиска гомологии. Результаты метода EMSA показали, что Gsh-1 действительно связывается с большинством консенсусных последовательностей в промоторе. Характеристики связывания каждого сайта могут несколько отличаться, потому что четкий сверхсдвиг наблюдался в G2 и G3, тогда как связывание было нарушено в G4 и G5. В любом случае функциональное значение связывания было подтверждено анализом делеции, который показал заметное снижение базовой транскрипционной активности, когда все сайты связывания были удалены. Однако индукция мутации в каждом сайте связывания не влияла на активность промотора, тогда как индукция во всех сайтах заметно снижала активность промотора гена GHRH, предполагая, что альтернативное связывание Gsh-1 необходимо и достаточно для поддержания активности промотора. Сходный регуляторный паттерн обнаружен в промоторе гена PRL крысы, в котором существуют четыре сайта связывания Pit-1, которые функционируют для поддержания транскрипционной активности (21, 22).

В этом исследовании мы также показали положительную роль CBP, белка-коактиватора, который повсеместно экспрессируется в ядрах большинства клеток. В частности, было обнаружено, что промоторная активность гена GHRH максимальна при совместной экспрессии CBP и Gsh-1, что свидетельствует о положительном взаимодействии между двумя факторами. Cohen et al. (15) сообщил о прямом взаимодействии между Pit-1 и CBP в регуляции промотора гена GH, и что аналогичный способ регуляции может происходить в промоторе GHRH.Однако наши усилия пока не смогли продемонстрировать белок-белковое взаимодействие между двумя факторами с использованием анализа GST pull-down или EMSA (с использованием полноразмерного in vitro, транслируемого CBP и слитого белка GST-Gsh-1). или дрожжевая двугибридная система (с использованием фрагментов CBP и Gsh-1) (данные не показаны). Таким образом, некоторые дополнительные неизвестные факторы могут быть необходимы для восстановления взаимодействия CBP с Gsh-1 in vitro. Эта гипотеза подтверждается нашими данными, показывающими, что синергия Gsh-1 / CBP не наблюдалась, когда каждый сайт связывания Gsh-1 по отдельности был локализован в гетерологичном промоторе.

Белки гомеобокса обычно играют важную роль в развитии и органогенезе на эмбриональной стадии. Фактически, Gsh-1-дефицитные мыши обнаруживают агенез нейронов GHRH в дугообразном ядре с карликовым фенотипом (10). Однако наши результаты, показывающие экспрессию мРНК Gsh-1 в гипоталамусе 7-месячной крысы, убедительно свидетельствуют о том, что белок Gsh-1 существует и играет важную роль в мозге зрелых животных.

Мы провели большинство экспериментов в этом исследовании с использованием линии плацентарных клеток JEG-3.Хотя клетки имеют эндогенную мРНК и пептид GHRH, считается, что экспрессия GHRH регулируется в основном плацентоспецифическим альтернативным промотором (23). Однако конструкция, которую мы использовали в наших экспериментах, включает только область промотора гипоталамуса и не содержит область, специфичную для плаценты, что указывает на то, что наблюдаемая регуляция не отражает специфический для плаценты промотор. Вместо этого результаты, вероятно, покажут гипоталамический способ регуляции из-за Gsh-1-зависимой регуляции, происходящей в промоторной области гипоталамуса.

Наконец, карликовый фенотип мышей с нокаутом Gsh-1 предполагает, что некоторые виды семейной карликовости человека могут быть вызваны мутацией гена Gsh-1. Поскольку мы клонировали человеческий гомолог гена Gsh-1, нуклеотидная последовательность которого теперь доступна, он является дополнительным возможным кандидатом для болезнетворных генов у карликовых пациентов, у которых не обнаружено мутации в GHRH, рецепторе GHRH или GH. гены. Дальнейшие исследования могут добавить в будущем новый тип генетической карликовости.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ОТ-ПЦР

Экспрессию Gsh-1 и GHRH в различных клеточных линиях и тканях взрослых крыс (см. Таблицу 1) исследовали методом ОТ-ПЦР.Тотальную РНК выделяли из монослойной культуры клеток или тканей взрослой крысы Sprague Dawley (Chubu Science Materials, Нагоя, Япония) с использованием реагента TRIzol (Life Technologies, Inc., Гейтерсбург, Мэриленд), и наносили по 1 мкг каждой для каждая реакция со специфическими наборами праймеров: смысловой 5′-GACAAGAAGGCTCCGGAGGG-3 ‘и антисмысловой 5′-CAGCTGGTTCGAGCTGCTGT-3′ для мРНК Gsh-1 человека / крысы; смысловой 5’-GGGTGTTCTTCTTTGTGATCC-3 ‘и антисмысловой 5′-TCACAGGAGGAATCTTCATC-3′ для мРНК человеческого GHRH; смысловой 5’-TATGCAGATGCCATCTTCACC-3 ‘и антисмысловой 5′-TCAAGCCTCCGCTGAAAGCT-3’ для мРНК GHRH крысы и мыши. Наборы праймеров для GHRH охватывают 3–5 экзонов и, таким образом, амплифицируют общие транскрипты GHRH. Образец РНК без обратной транскриптазы использовали в качестве отрицательного контроля.

Плазмидные конструкции

5′-фланкирующая область гена GHRH крысы (от -472 до +71; +1 обозначает сайт начала транскрипции), любезно предоставленная доктором Келли Э. Мэйо (Северо-Западный университет, Эванстон, Иллинойс) (7), была слит с репортерным геном люциферазы в плазмиде pA3Luc (GRH ₄₇₂ Luc).Также были сконструированы делеционные мутанты различной длины промотора (GRH ₃₀₄ Luc, GRH ₂₄₇ Luc, GRH ₁₈₇ Luc, GRH ₁₃₃ Luc, GRH ₄₇ Luc). Мутированные конструкции GRH ₄₇₂ Luc (mG1, mG2, mG3, mG4, mG5 и mG1–5) (см. Подробности на рис. 5) были сконструированы с помощью методики сайт-направленного мутагенеза на основе ПЦР (24). Конструкции Gsh-TK-Luc (G2-TK-, G3-TK-, G4-TK- и G5-TK-Luc) были сконструированы путем вставки отожженных олигонуклеотидов в плазмиду pFlashII (SynapSys Co., Burlington, MA), содержащий минимальный промотор тимидинкиназы (TK): смысловой 5′-GGCCGAAATATAATTACTAGG-3 ‘и антисмысловой 5′-GATCCCTAGTAATTATATTTC-3′ для G2; смысловой 5’-GGCCGATTCAACATTATATTG-3 ‘и антисмысловой 5′-GATCCAATATAATGTTGAATC-3′ для G3; смысловой 5’-GGCCGGGTCTAAATTAGTGGG-3 ‘и антисмысловой 5′-GATCCCCACTAATTTAGACCC-3′ для G4; смысловой 5’-GGCCGTTTCCCCATTACTTTG-3 ‘и антисмысловой 5′-GATCCAAACTAATGGGGAAAC-3’ для G5. КДНК Gsh-1 мыши выделяли из геномной ДНК мыши и субклонировали в вектор экспрессии млекопитающих pRC / RSV (вирус саркомы Рауса) (Invitrogen, Groningen, Нидерланды).Анализ последовательности был выполнен для всех конструкций, полученных с помощью ПЦР. Доктор Тошихиро Накашима (Университет Цукуба, Цукуба, Ибараги, Япония) любезно предоставил вектор экспрессии CBP (RSV-CBP).

Культура клеток и трансфекция

Линия плацентарных клеток человека JEG-3 и линии нейрональных клеток гипоталамуса мыши (Gsh + / +, Gsh — / -) выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS. Культуры поддерживали при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO ₂ . В каждом эксперименте клетки высевали по 3.5-сантиметровые чашки с 70% конфлюэнтностью (~ 2 × 10 ⁶ клеток на чашку) и используемые плазмиды (3 мкг тестовых плазмид и 0,3 мкг вектора экспрессии β-галактозидазы в качестве внутреннего контроля на чашку) были трансфицированы TransIT LT-100 (Mirus, Madison, WI). В исследованиях коэкспрессии Gsh-1 или CBP использовали 0,3–0,6 мкг плазмид экспрессии Gsh-1 / CBP или пустой вектор (только промотор), чтобы общее количество вектора экспрессии было равным.

Через 48 часов после трансфекции клетки собирали с буфером для лизиса, содержащим 1% Triton X-100, и центрифугировали, а супернатанты использовали для анализов люциферазы и β-галактозидазы.Люциферазный анализ выполняли, как описано ранее (25). Вкратце, 100 мкл каждого супернатанта добавляли к 400 мкл реакционного буфера, и реакции запускали путем инъекции 200 мкл раствора люциферина, содержащего 0,2 ммд-люциферин (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Световой выход измеряли в течение 20 секунд при комнатной температуре с помощью люминометра (Lumat LB 9501, EG&G Berthold, Oak Ridge, TN). Анализ β-галактозидазы определяли с использованием имеющихся в продаже наборов для анализа (Galacto-Light Plus Kit, Tropix, Inc., Бедфорд, Массачусетс) в соответствии с инструкциями производителя. Активности люциферазы были разделены на активности β-галактозидазы для корректировки эффективности трансфекции.

Получение гибридного белка

кДНК Gsh-1 мыши была включена в плазмиду pcDNA 3.1 / myc-His (+) A (Invitrogen). После того, как кДНК, меченная myc, была субклонирована в вектор экспрессии pGEX 4T-2 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) для получения слитого белка, меченного GST и myc, белковый продукт впоследствии очищали с использованием гранул глутатион-сефарозы 4B (Amersham Pharmacia Биотех).Вестерн-блоттинг меченого белка с использованием антитела против Myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Санта-Крус, Калифорния) показал единственную полосу подходящего размера. Очищенный гибридный белок использовали в EMSA, как показано ниже.

EMSA

Для анализа связывания с белками синтетические двухцепочечные олигонуклеотиды, включающие Gsh-1 связывающие последовательности 5′-промоторной области GHRH крысы (G1: смысловой, 5′-TGAACAAAACAGAATTATAGGG-3 ‘, антисмысловой, 5′-AGTTCCCTATAATTCG-3’T’T; G2: смысл, 5’-TGGTAAATATAATTACTAGA-3 ‘, антисмысловой, 5′-AGAGTCTAGTAATTATATTT-3′; G3: смысл, 5’-TAGTCATTCAACATTATATTC-3 ‘, антисмысловой, 5′-TGAACAGAATATAATGTTGAATG-3’; -GTATGGGTCTAAATTAGTGGG-3 ‘, антисмысловой, 5′-TGCCCCCACTAATTTAGACCC-3′; G5: смысловой, 5’-CGACTTTTCCCCATTAGTTTG-3 ‘, антисмысловой, 5’-CACGCAAACTAATGGGGAA-де-900, меченный [α84], был помечен как 900- CTP (Amersham Pharmacia Biotech) и ДНК-полимераза (фермент Кленова, New England Biolabs, Inc., Беверли, Массачусетс). Меченый фрагмент (2–5 фмоль, 40 000 имп / мин) затем инкубировали с 1-2 мкг слитых белков GST gsh-1-Myc в связывающем буфере EMSA (40 мМ HEPES, pH 7,9, 75 мМ KCl, 0,2 мМ EDTA, 10% глицерина, 1 мМ дитиотреитола) и 2 мкг poly dI-dC (Amersham Pharmacia Biotech) в течение 15 мин на льду. Чистый белок GST использовали в качестве контроля. Для конкурентных анализов к реакционному раствору добавляли 100-кратный молярный избыток немеченого зонда. Для анализа сверхсдвига антитело против Myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) добавляли к реакционной смеси и инкубировали еще 60 мин на льду. Затем смесь обрабатывали 4% неденатурирующим полиакриламидным гелем и проводили электрофорез при 160 В с охлаждением в течение 4 часов. Гели сушили и подвергали авторадиографии, экспонируя гель пленкой Kodak X-AR (Eastman Kodak Co., Рочестер, штат Нью-Йорк).

Анализ данных

образца в каждой группе экспериментов были в трех экземплярах. Все эксперименты были повторены три раза в независимые моменты времени, и данные представлены как среднее ± стандартная ошибка усредненных данных из трех экспериментов. При выполнении статистического анализа данные сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с защищенным критерием наименьшего значимого различия Фишера, и значения P <0,05 считались значимыми.

Благодарности

Мы благодарны докторам. Келли Э. Мэйо (Северо-Западный университет, Эванстон, Иллинойс) и Стивену С. Поттеру (Университет Цинциннати, Цинциннати, Огайо) за предоставление гена GHRH крысы и клеток Gsh + / +, — / — соответственно. Мы также благодарим доктора Тошихиро Накашима (Университет Цукуба, Цукуба, Япония) за предоставление вектора экспрессии CBP.

Эта работа была частично поддержана премией Novo Nordisk Growth Award (Y.I.), Япония.

Сокращения:

• CBP,

• GST,

  глутатион- S -трансфераза;

• RSV,

• TK,

1

Mayo

KE

,

Godfrey

PA

,

Suhr

ST

,

000 DJ5000 J5000

Kulik4 9000 Ra

1995

Гормон, высвобождающий гормон роста: синтез и передача сигналов.

Недавнее исследование гормона роста

50

:

35

—

73

2

Даугадей

WH

2000

Обзор оси гормона роста — гипотеза соматомедина.

Педиатр Нефрол

14

:

537

—

540

3

Frohman

LA

,

Kineman

RD

,

Kamegai

Park4

, Kamegai

J

, LT

,

Coschigano

KT

,

Kopchic

JJ

2000

Секретагоги и соматотроп: передача сигналов и распространение.

Недавнее исследование Prog Horm Res

55

:

269

—

290

4

Guillemin

R

,

Brazeau

P

,

Bohlen

P

,

N

,

Wehrenberg

WB

1982

Фактор высвобождения гормона роста из опухоли поджелудочной железы человека, вызвавшей акромегалию.

Наука

218

:

585

—

587

5

Rivier

J

,

Spiess

J

,

Thorner

M

000

1982 Vale5

000

Вале 5 фактора высвобождения гормона роста из опухоли островков поджелудочной железы человека.

Nature

300

:

276

—

278

6

Mayo

KE

,

Cerelli

GM

,

Lebo

RV

000

Bruce

MG

,

Evans

RM

1985

Ген, кодирующий предшественник фактора высвобождения гормона роста человека: структура, последовательность и хромосомная принадлежность.

Proc Natl Acad Sci USA

82

:

63

—

67

7

Mayo

KE

,

Cerelli

GM

,

Rosenfeld

000 MG 9000

9000 MG 9000 Evans 1985

Характеристика кДНК и геномных клонов, кодирующих предшественник фактора высвобождения гипоталамического гормона роста крыс.

Nature

314

:

464

—

467

8

Suhr

ST

,

Rahal

JO

,

Mayo

KE

структура предшественника гормона роста: и экспрессия в головном мозге и плаценте.

Mol Endocrinol

3

:

1693

—

1700

9

Валериус

MT

,

Li

H

,

Stock

JL

,

0005

Weinstein S

,

Singh

G

,

Potter

SS

1995

Gsh-1: новый ген гомеобокса мыши, экспрессируемый в центральной нервной системе.

Dev Dyn

203

:

337

—

351

10

Li

H

,

Zeitler

PS

,

Valerius

MT

,

K Small

,

K SS

1996

Gsh-1, сиротский ген Hox, необходим для нормального развития гипофиза.

EMBO J

15

:

714

—

724

11

Melino

G

,

Stephanou

A

,

Annicchiarico-Petruzzelli

Agilent

M

Knight

RA

,

Lightman

SL

1992

Экспрессия мРНК IGF-II в клеточной линии глиобластомы человека LI параллельна росту клеток.

Neurosci Lett

144

:

25

—

28

12

Savarese

A

,

Annicchiarico-Petruzzelli

M

,

Citro

G40005

G40005

LG

,

Colantoni

A

,

Vernole

P

,

Stephanou

A

,

Knight

RA

,

Guerrieri

P

P

Melino

Характеристика линии клеток глиобластомы человека (LI), экспрессирующих гормоны гипоталамуса и гипофиза.

Exp Brain Res

89

:

408

—

414

13

Иноуэ

K

,

Хаттори

M

,

Сакаи

T

Inoue

Inoue

N

,

Ito

A

1990

Создание серии клональных клеточных линий гипофиза, различающихся по морфологии, секреции гормонов и реакции на эстроген.

Эндокринология

126

:

2313

—

2320

14

Li

H

,

Schrick

JJ

,

Fewell

GD

arland

Witt

,

Bodenmiller

DM

,

Hsieh-Li

HM

,

Su

CY

,

Potter

SS

1999

Цели нового поколения с использованием гипоталамуса хомеотлама с помощью генофонда-кандидата на основе гипоталамуса. линий.

Dev Biol

211

:

64

—

76

15

Коэн

LE

,

Хашимото

Y

,

Zanger

K

000

000

000 Wond

Wond S

1999

CREB-независимая регуляция CBP представляет собой новый механизм экспрессии гена гормона роста человека.

J Clin Invest

104

:

1123

—

1130

16

Pfaffle

RW

,

DiMattia

GE

,

Parks

JS4

,

Parks

JS4

9000 Wit

JM

,

Jansen

M

, Van der

Nat

H

, Van den

Brande

JL

,

Rosenfeld

MG

,

Ingraham

HA

HA POU-специфический домен Pit-1 и гипопитуитаризм без гипоплазии гипофиза.

Наука

257

:

1118

—

1121

17

Радовик

S

,

Наций

M

,

Du

Y

,

Berg

Berg

,

Wondisford

FE

1992

Мутация в POU-гомеодомене Pit-1, ответственная за комбинированный дефицит гормона гипофиза.

Наука

257

:

1115

—

1118

18

Тацуми

K

,

Мияи

K

,

Нотоми

T

,

000

000 Кайбе

,

000 Кайбе

,

Mizuno

Y

,

Kohno

H

1992

Кретинизм с комбинированным дефицитом гормонов, вызванный мутацией в гене PIT1.

Нат Генет

1

:

56

—

58

19

Накаи

S

,

Кавано

H

,

Юдате

T

,

000

000

000

000

000

000

000 M J

,

Nagata

A

,

Jishage

K

,

Hamada

H

,

Fujii

H

,

Kawamura

K

,

000 Noda

Shib

1995

Фактор транскрипции домена POU Brn-2 необходим для определения конкретных нейрональных клонов в гипоталамусе мыши.

Genes Dev

9

:

3109

—

3121

20

Acampora

D

,

Postiglione

MP

,

Avantaggiato

FM

,

Michaud

J

,

Simeone

A

1999

Прогрессирующее нарушение развивающихся линий нейроэндокринных клеток в гипоталамусе мышей, лишенных гена ортопедии.

Genes Dev

13

:

2787

—

2800

21

Iverson

RA

,

Day

KH

,

d’Emden

M

,

0004 Day

RA

1990

Анализ кластерных точечных мутаций промотора пролактина крыс.

Mol Endocrinol

4

:

1564

—

1571

22

Nowakowski

BE

,

Maurer

RA

1994

сайтов связывания эстрогеновых генов множественного Pit-связывания .

Mol Endocrinol

8

:

1742

—

1749

23

Gonzalez-Crespo

S

,

Boronat

A высвобождает

гормона роста 1991

9000t4 Экспресс гормона роста направляется альтернативным промоутером.

Proc Natl Acad Sci USA

88

:

8749

—

8753

24

Higuchi

R

1990

Рекомбинантная ПЦР

.В:

Гельфанд

DH

,

Innis

MA

,

Sninsky

JJ

,

White

TJ

, ред.

Протоколы ПЦР

.

Руководство по методам и приложениям. Сан-Диего

:

Academic Press, Inc.

;

177

—

183

25

Iwasaki

Y

,

Oiso

Y

,

Saito

H

,

Majzoub

JA

Положительное регулирование генов и отрицательное регулирование v. промоутер.

Эндокринология

138

:

5266

—

5274

Авторские права © 2001 Общество эндокринологов

Безопасность | Стеклянная дверь

Мы получаем подозрительную активность от вас или кого-то, кто пользуется вашей интернет-сетью. Подождите, пока мы убедимся, что вы настоящий человек. Ваш контент появится в ближайшее время. Если вы продолжаете видеть это сообщение, напишите нам чтобы сообщить нам, что у вас проблемы.

Nous aider à garder Glassdoor sécurisée

Nous avons reçu des activités suspectes venant de quelqu’un utilisant votre réseau internet. Подвеска Veuillez Patient que nous vérifions que vous êtes une vraie personne. Вотре содержание apparaîtra bientôt. Si vous continuez à voir ce message, veuillez envoyer un электронная почта à pour nous informer du désagrément.

Unterstützen Sie uns beim Schutz von Glassdoor

Wir haben einige verdächtige Aktivitäten von Ihnen oder von jemandem, der in ihrem Интернет-Netzwerk angemeldet ist, festgestellt.Bitte warten Sie, während wir überprüfen, ob Sie ein Mensch und kein Bot sind. Ihr Inhalt wird в Kürze angezeigt. Wenn Sie weiterhin diese Meldung erhalten, informieren Sie uns darüber bitte по электронной почте: .

We hebben verdachte activiteiten waargenomen op Glassdoor van iemand of iemand die uw internet netwerk deelt. Een momentje geduld totdat, мы выяснили, что u daadwerkelijk een persoon bent. Uw bijdrage zal spoedig te zien zijn. Als u deze melding blijft zien, электронная почта: om ons te laten weten dat uw проблема zich nog steeds voordoet.

Hemos estado detectando actividad sospechosa tuya o de alguien con quien compare tu red de Internet. Эспера mientras verificamos que eres una persona real. Tu contenido se mostrará en breve. Si Continúas recibiendo este mensaje, envía un correo electrónico a para informarnos de que tienes problemas.

Hemos estado percibiendo actividad sospechosa de ti o de alguien con quien compare tu red de Internet. Эспера mientras verificamos que eres una persona real.Tu contenido se mostrará en breve. Si Continúas recibiendo este mensaje, envía un correo electrónico a para hacernos saber que estás teniendo problemas.

Temos Recebido algumas atividades suspeitas de voiceê ou de alguém que esteja usando a mesma rede. Aguarde enquanto confirmamos que Você é Uma Pessoa de Verdade. Сеу контексто апаресера эм бреве. Caso продолжить Recebendo esta mensagem, envie um email para пункт нет informar sobre o проблема.

Abbiamo notato alcune attività sospette da parte tua o di una persona che condivide la tua rete Internet.Attendi mentre verifichiamo Che sei una persona reale. Il tuo contenuto verrà visualizzato a breve. Secontini visualizzare questo messaggio, invia un’e-mail all’indirizzo per informarci del проблема.

Пожалуйста, включите куки и перезагрузите страницу.

Это автоматический процесс. Ваш браузер в ближайшее время перенаправит вас на запрошенный контент.

Подождите до 5 секунд…

Перенаправление…

Заводское обозначение: CF-102 / 639c7cca98d03a77.

питательных веществ | Бесплатный полнотекстовый | Влияние глутатиона и витамина B-6 на пациентов с циррозом: рандомизированное контролируемое испытание и последующее исследование

1.Введение

Прогрессирование цирроза печени — это многофакторный процесс, который включает повторяющееся повреждение гепатоцитов и последующее необратимое рубцевание. Кроме того, у пациентов с циррозом печени наблюдались повышенный окислительный стресс и снижение антиоксидантной способности [1,2,3,4,5]. Следовательно, для пациентов с циррозом важно восстановить баланс окислительного стресса и антиоксидантной способности или даже использовать более сильную антиоксидантную защиту, чтобы защитить печень от дальнейшего повреждения, а также замедлить прогрессирование заболевания.Глутатион (GSH) и родственные ему ферменты [например, глутатион-S-трансфераза (GSH-St), глутатионпероксидаза (GSH-Px), глутатионредуктаза (GSH-Rd)] — хорошо известные антиоксиданты человеческого организма, которые захватывают токсичные электрофильные ксенобиотики и удаляют свободные радикалы [6]. GSH в основном синтезируется цистеином, глицином и глутаматом в печени, окисляется до дисульфида глутатиона (GSSG) с помощью GSH-Px и восстанавливается обратно до GSH с помощью GSH-Rd. Поскольку печень является основой общего обмена GSH в организме и на ее долю приходится более 90% притока GSH в системный кровоток [7], сообщалось, что базальная частота появления эндогенного GSH у пациентов с циррозом снижается на 50% по сравнению со здоровыми. у пациентов, а частота появления GSH достоверно коррелирует с функцией печени [8].Leach et al. наблюдали, что пациенты с неалкогольной жировой болезнью печени имели значительно более низкие уровни GSH и активности GSH-Px по сравнению со здоровым контролем [9]. Дисфункция печени, по-видимому, нарушает синтез GSH, и повышение статуса GSH может быть эффективным для поддержания уровня GSH и связанных с ним антиоксидантных способностей у пациентов с циррозом печени. Хотя четырехнедельный прием перорального GSH (1000 мг / сут) не изменяет концентрацию GSH в эритроцитах и ​​не снижает уровень показателей окислительного стресса у здоровых взрослых [10], концентрация GSH в плазме значительно повышается после трех и шести месяцев приема. пероральный прием GSH (1000 мг / сут) здоровым людям [11].Период с добавкой GSH, по-видимому, имеет решающее значение для эффективности, и для здоровых субъектов необходимо минимум три месяца. Тем не менее, пероральные добавки GSH не были связаны с пациентами с циррозом печени, а эффективность пероральных добавок GSH в отношении окислительного стресса и антиоксидантной способности еще не была определена. В качестве ограничивающего скорость субстрата для биосинтеза GSH цистеин можно получить из диеты или через путь транссульфурации для превращения гомоцистеина в цистеин через пиридоксаль-5′-фзофат (PLP, физиологическая коферментная форма витамина B-6), действующий как важный кофермент [12].Поскольку печень является основным местом хранения и метаболизма витамина B-6, дефицит витамина B-6 может косвенно влиять на синтез GSH и впоследствии влиять на антиоксидантную способность GSH и связанных с ним ферментов. Предыдущее исследование на животных показало, что недостаток витамина B-6 вызывает снижение уровня GSH, а также активности GSH-Px и GSH-Rd в ткани печени крыс [13]. Хотя однократная доза витамина B-6 (50 мг / сут) не показала значительного влияния на уровни GSH и GSSG и активность GSH-Px, GSH-Rd и GSH-St у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой [14 ], комбинация добавок витамина B-6 и GSH, вероятно, окажет антиоксидантное действие у пациентов с циррозом печени.Поскольку нарушение статуса витамина B-6 и GSH наблюдалось у пациентов с циррозом печени [15,16,17,18,19], требуется стратегия либо для поддержания адекватного уровня витамина B-6 и GSH, либо для его повышения. справиться с измененным окислительным стрессом и антиоксидантными способностями у этой конкретной группы пациентов. Однако остается неясным, может ли добавление витамина B-6 или GSH компенсировать их пониженный статус и улучшить антиоксидантную способность пациентов с циррозом печени.Это исследование было направлено на оценку того, влияет ли прием витамина B-6 и GSH на окислительный стресс и антиоксидантные способности у пациентов с циррозом печени. Кроме того, мы наблюдали за пациентами после окончания приема добавок, чтобы оценить связь витамина B-6 и GSH с тяжестью заболевания.

2. Предметы и методы исследования

2.1. Дизайн исследования и расчет размера выборки

Это было двойное слепое рандомизированное клиническое испытание (клиническое испытание №NCT02321579, ClinicalTrials.gov Протокол и система регистрации результатов) с факторным дизайном 2 × 2 и последующим исследованием. На основании результатов Richie et al. [11], которые показали, что уровень общего GSH в крови увеличился с 1,04 ± 0,11 моль / мл до 1,22 ± 0,31 моль / мл у здоровых взрослых после 6 месяцев приема 250 мг / сут пероральных добавок GSH, затем мы предположили, что будет разница 17% в среднем уровне GSH в плазме между группой, получавшей плацебо и GSH, со стандартным отклонением 0.2 моль / мл. Минимальный требуемый размер выборки составлял 12 пациентов в группе при мощности 80% и двустороннем тесте с α = 0,05.

2.2. Субъекты

Мы набрали для исследования пациентов из отделения общей хирургии и отделения гастроэнтерологии и гепатологии больницы общего профиля для ветеранов Тайчжун, Тайвань. Пациентам был поставлен диагноз цирроз печени на основании клинических проявлений, а также гистопатологических, биохимических и радиологических отчетов. Схема классификации Чайлда – Туркотта – Пью [20] использовалась в качестве оценки тяжести цирроза печени в соответствии с концентрациями сывороточного альбумина и общего билирубина, международным нормализованным соотношением (МНО), а также степенью асцита и печеночной энцефалопатии; оценка 5–6 относится к классу A, оценка 7–9 — к классу B, а оценка 10–15 — к классу C.Пациенты были исключены, если им было 80 лет, у них был декомпенсированный цирроз печени в критическом клиническом состоянии, беременны или кормили грудью, получали химиотерапию или если у них были диабетические, сердечно-сосудистые, почечные или хронические воспалительные заболевания. Это исследование было одобрено Наблюдательным советом больницы для ветеранов Тайчжун (IRB TCVGH No. SF14261B), и все пациенты подписали информированное согласие до участия в исследовании.

2.3. Вмешательство и процедура последующего наблюдения

Ни один из исследуемых пациентов не получал добавки витамина B-6 или GSH за месяц до исследования.В общей сложности 61 пациент был случайным образом распределен в одну из четырех групп исследования с использованием следующего порядкового номера из списка рандомизации, созданного QuickCalus (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Четыре исследовательские группы состояли из группы плацебо (декстриновый крахмал, New Health Entereprise, Inc., Ирвин, Калифорния, США, n = 14), группы витамина B-6 (50 мг / день пиридоксина-HCl, Nature’s Way Products, Inc. ., США, n = 14), группа GSH (500 мг / сут L-глутатиона, Chambio Co., Ltd., Тайчжун, Тайвань, n = 18) и группа B-6 + GSH (50 мг / сут витамина B-6 и 500 мг / сут GSH, n = 15).

Добавку вводили в течение 12 недель, и таблетки были неотличимы по цвету, размеру и форме. Пациенты были проинструктированы принимать таблетки ежедневно и следить за тем, чтобы они сохраняли обычную диету и повседневную активность в течение периода вмешательства. Чтобы контролировать соблюдение режима лечения, когда пациенты возвращались в клинику за дополнительными добавками, все неиспользованные таблетки за предыдущие 4 недели возвращались и подсчитывались.

После окончания вмешательства (12-я неделя) мы наблюдали за 61 пациентом с даты завершения вмешательства до конца исследования 31 октября 2019 г.В течение периода наблюдения пациенты не принимали ни витамин B-6, ни GSH. Первичным результатом была тяжесть заболевания (оценка по шкале Чайлда – Тюркотта – Пью). Дизайн и блок-схема исследования показаны на Рисунке 1.

2.4. Сбор данных и биохимические измерения

Регистрировались возраст, пол, курение и привычки питья, а также измерялись рост, вес, систолическое и диастолическое артериальное давление после периода покоя не менее 5 минут на исходном уровне (неделя 0), а также масса тела индекс (ИМТ, ​​кг / м ² ).

Образцы крови натощак отбирали и собирали в вакуумные пробирки (Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA) с антикоагулянтом или без него на неделе 0 и неделе 12. Сыворотка или плазма были немедленно отделены после забора крови путем скоростного центрифугирования при 2500 об / мин. 4 ° C, в течение 15 мин. Образцы либо анализировали напрямую, либо замораживали и хранили при -80 ° C до анализа. Образцы сыворотки использовали для измерения альбумина, общего билирубина, INR, аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и креатинина с использованием автоматического биохимического анализатора.Образцы плазмы использовались для определения уровней малонового диальдегида (MDA), цистеина, PLP, GSH, GSSG и эквивалентной антиоксидантной способности тролокса (TEAC), а также активности GSH-Px, GSH-Rd и GSH-St. В качестве индикатора окислительного стресса уровни МДА измеряли с веществами, реагирующими с тиобарбитуровой кислотой, с помощью флуоресцентного спектрофотометра [21]. Цистеин и PLP были количественно определены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором на основе модифицированных методов [22,23]. Уровни GSH, GSSG и активности GSH-Px, GSH-St, SOD и каталазы определяли с использованием соответствующих коммерческих наборов (BioVision Incorporate, Милпитас, Калифорния, США; Cayman Chemical Company, Анн-Арбор, Мичиган, США). в то время как активность GSH-Rd оценивали по методу Карлберга и Маннервика [24].TEAC оценивался согласно ранее описанной методике [25].

2,5. Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием пакета статистических программ SAS (версия 9.4; Statistical Analysis System Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США). В этом клиническом исследовании применялся анализ «намерение лечиться». Для проверки нормальности выборочных распределений использовался критерий Шапиро – Уилка. Демографические, клинические и биохимические параметры сравнивали с использованием одностороннего дисперсионного анализа или одностороннего дисперсионного анализа рангов Крускала-Уоллиса для определения значимых различий между группами на неделе 0 и неделе 12.При анализе категориальных переменных использовались критерии хи-квадрат или точные критерии Фишера. Парный t-критерий или знаковый ранговый критерий Уилкоксона использовались для сравнения разницы в биохимических параметрах внутри групп между неделей 0 и 12 недель. Для оценки эффекта от приема добавок использовали множественную линейную регрессию (плацебо = 1, B-6 = 2, GSH = 3, B-6 + GSH = 4) на окислительный стресс и антиоксидантные способности после поправки на возраст, пол, ИМТ, исходный уровень (неделя 0) по шкале Чайлда – Тюркотта – Пью, а также привычки к курению и употреблению алкоголя.Кроме того, для оценки влияния окислительного стресса и антиоксидантной способности на тяжесть цирроза печени после поправка на потенциальные искажающие факторы. Результаты считались статистически значимыми при двустороннем исследовании, p <0,05.

3. Результаты

Ни один из пациентов не выбыл за период вмешательства. В целом было 95,02 ± 1.18% и 92,62 ± 1,67% (среднее ± стандартная ошибка среднего) комплаентность у всех пациентов по количеству таблеток на неделе 0 и неделе 12, соответственно, и степень комплаентности не различалась между группами. Кроме того, пациенты исследования не сообщили о серьезных побочных эффектах в течение периода вмешательства.

В таблице 1 перечислены демографические и клинические характеристики пациентов на 0-й и 12-й неделе. Пациенты из исследования относились к классам A и B по шкале Чайлд-Пью, и пациенты имели аналогичные значения возраста, пола, ИМТ, САД, ДАД, сывороточный альбумин, АЛТ, АСТ и креатинин, а также показатели по шкале Чайлда – Тюркотта – Пью среди групп на 0 и 12 неделе.Ответы пациентов с точки зрения биохимических параметров на плацебо или добавки показаны в таблице 2. Все пациенты имели одинаковые уровни цистеина, MDA, GSH, GSSG и активности ферментов на неделе 0. B-6 и B-6 + GSH. У пациентов группы значительно повысились уровни PLP в плазме на 12 неделе по сравнению с уровнями на неделе 0. Неожиданно, уровни GSH и связанные с ним ферментативные активности оставались стабильными после 12 недель приема GSH в группах GSH и B-6 + GSH. Активность GSH-Px значительно снизилась у пациентов, принимавших плацебо и добавку B-6 на 12 неделе.Множественный регрессионный анализ показал, что ни витамин B-6, ни GSH не оказали значительного влияния на показатели окислительного стресса и антиоксидантные способности после поправки на возможные факторы (данные не показаны), поскольку добавление витамина B-6 и GSH существенно не улучшило GSH. уровни в плазме или связанные с ними антиоксидантные способности, мы решили изучить любые изменения тяжести заболевания (шкала Чайлда – Тюркотта – Пью) с течением времени. В таблице 3 показаны ассоциации тяжести цирроза печени с биохимическими параметрами до (0-я неделя) и после (12-я неделя) приема добавок и в конце периода наблюдения.Среднее время наблюдения составило 984 дня (межквартильный размах, 835-1530,5 дней; минимум 77 дней; максимум 1689 дней), и 21 пациент был потерян из-под наблюдения. В конце периода наблюдения средняя и стандартная ошибка среднего значения по шкале Чайлда – Тюркотта – Пью составила 5,25 ± 0,11 для 40 пациентов. Значимых ассоциаций между оценкой по шкале Чайлда – Тюркотта – Пью и уровнями PLP, цистеина и MDA в плазме не наблюдалось. Только высокие уровни GSH, высокое соотношение GSH / GSSG и высокая активность GSH-St на исходном уровне (неделя 0), но не на неделе 12, оказали значительное влияние на низкие показатели по шкале Чайлда-Теркотта-Пью на неделе 0, неделе 12 и конец наблюдения за всеми пациентами после поправки на возраст, пол, ИМТ, статус курения и употребления алкоголя, а также время наблюдения.

4. Обсуждение

Было показано, что витамин B-6 оказывает как прямое [26,27], так и непрямое антиоксидантное действие на организм человека. Адекватный статус витамина B-6 может защитить пациентов от высокого окислительного стресса, вызванного их заболеваниями. В нашем предыдущем исследовании добавление 50 мг витамина B-6 в течение 12 недель могло опосредовать антиоксидантную способность за счет снижения гомоцистеина в плазме у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой [14], как следствие, мы использовали ту же дозировку (50 мг / день пиридоксин-HCl) для лечения наших пациентов в настоящем исследовании.Хотя уровень PLP в плазме значительно увеличился в 2,7–5 раз по сравнению с исходным уровнем после 12-недельного ежедневного приема 50 мг витамина B-6, никаких явных положительных эффектов на окислительный стресс и антиоксидантные способности у пациентов с циррозом печени не наблюдалось. настоящее исследование. Точно так же однократный пероральный прием 25 мг пиридоксина и 28-дневный курс ежедневного приема 25 мг пиридоксина могут успешно восполнить уровни PLP в плазме у пациентов с циррозом печени [17,28], но добавка не может улучшить их нарушенный метаболизм аминокислот [17, 28]. 17].Однако ранее было продемонстрировано, что введение витамина B-6 (100 мг / кг) значительно уменьшало индуцированный хромом окислительный стресс у крыс [29]. Действительно, введение однократной дозы витамина B-6 (600 мг / кг, подкожно) непосредственно крысам с перевязкой слепой кишки и перфорацией, вызванной сепсисом средней степени злокачественности, может значительно снизить острое окислительное повреждение печени [30]. Поскольку Horowitz et al. предположили нарушение пути транссульфурации у пациентов с циррозом [31], мы предположили, что антиоксидантные свойства витамина B-6 могут быть нарушены или заблокированы при циррозе, даже несмотря на то, что уровни PLP в плазме увеличиваются после приема большой дозы витамина B-6.Истощение GSH может привести к перепроизводству активных форм кислорода, что может нарушить митохондриальный трансмембранный потенциал и привести к митохондриальной дисфункции [32]. В результате соотношение GSH / GSSG было использовано для оценки статуса окислительного стресса в клетках [33]. Было показано, что снижение активности клеток GSH-Px и SOD вызывает апоптоз [34]. Усиление окислительного стресса вовлечено в патогенез и прогрессирование различных заболеваний печени; Следовательно, для защиты печени от окислительного повреждения необходим достаточный статус GSH и связанные с ним антиоксидантные ферментативные активности.Об эффективности добавок GSH сообщалось при различных заболеваниях, включая муковисцидоз, периферическую обструктивную артериальную болезнь, болезнь Паркинсона и расстройства аутистического спектра [35,36,37,38]. Используются различные пути введения, такие как внутривенный, ингаляционный или пероральный. Предыдущее исследование показало, что пероральное введение GSH (1 г / кг массы тела) значительно увеличивало уровень GSH в печени у крыс [39], и поэтому мы предположили, что добавление GSH может также увеличить концентрацию GSH в плазме у пациентов с циррозом.В отличие от витамина B-6, уровень GSH в плазме и связанная с ним ферментативная активность не реагировали на 12-недельный ежедневный прием 500 мг GSH. Неадекватная доза GSH (500 мг / сут) считалась причиной несущественных результатов в плазме крови. Насколько нам известно, это первое исследование по пероральному введению GSH пациентам с циррозом печени; у нас не было рекомендаций о безопасной пероральной дозе GSH для пациентов с циррозом печени, хотя ранее пероральная добавка GSH в дозе 1000 мг / сут давалась здоровым субъектам [10,11].Недавнее исследование перорального приема глутатиона в дозе 300 мг в день продемонстрировало эффективность в отношении улучшения уровней АЛТ после четырехмесячного курса лечения у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени; однако уровни GSH во фракции белков плазмы значительно снизились [40]. Поскольку мы не наблюдали каких-либо побочных эффектов у пациентов с циррозом печени во время и после вмешательства, можно было бы рассмотреть более высокую дозу GSH. Нарушение пути деградации метионина и транссульфурации наблюдается у пациентов с циррозом печени [18,41].В самом деле, возможно, что большая доза GSH не может компенсировать дефектный путь транссульфурации при циррозе, что может объяснить, почему уровень GSH не был значительно повышен после приема GSH. Предыдущее исследование показало, что GSH может ингибировать агрегацию тромбоцитов [42], а свертывание крови было чувствительным к окислительно-восстановительной паре GSH in vitro [43]. INR — это анализ, оценивающий внешний и общий путь каскада свертывания для измерения факторов свертывания. Мы заметили значительную разницу в уровне МНО между группами витамина B-6 и GSH на нулевой неделе.Хотя средний уровень МНО был в пределах нормы (0,8–1,2) на неделе 0 и неделе 12, а значительная разница в уровне МНО между группами исчезла на 12 неделе, метаболизм GSH может зависеть от каскада свертывания крови после приема GSH. Кроме того, перорально принятый GSH абсорбировался в крови и инкорпорировался в печень для поддержания резервуара GSH или для облегчения истощения GSH из печени при патологическом состоянии цирроза. Таким образом, мы не могли исключить возможность поглощения GSH тканями; Другими словами, во время приема GSH может происходить перераспределение GSH из плазмы в ткань печени, поскольку пациентам с циррозом печени может потребоваться больше GSH и связанных с ним антиоксидантных ферментов для защиты их поврежденной функции печени.Однако, поскольку концентрацию GSH в печени определить не удалось, мы не смогли дополнительно прояснить это предположение. Независимо от причины отсутствия реакции уровней GSH в плазме на вмешательство, этим можно объяснить отсутствие связи между уровнями GSH в плазме и активностью его антиоксидантных ферментов с показателями окислительного стресса и антиоксидантной способности. Исследование in vivo продемонстрировало, что селен -Обогащенные GSH пробиотики могут эффективно повышать уровень GSH в печени и активность GSH-Px и SOD, а также ослаблять индуцированный тетрахлорметаном оксидативный стресс печени и фиброз печени у крыс; это исследование также показало, что эта комбинация пробиотиков лучше защищает от фиброза печени, чем селен или GSH по отдельности [44].Действительно, только обогащенные селеном, а не комбинация пробиотиков селена и GSH, также может значительно повысить уровень GSH в печени, активности GSH-Px и SOD и дополнительно подавить окислительный стресс печени у крыс [45]. Селен является важным субстратом для GSH-Px, и адекватный статус селена может быть важным ключевым фактором в антиоксидантной способности, связанной с GSH. Незначительное положительное влияние добавок GSH на окислительный стресс и антиоксидантные способности может быть связано с неадекватным статусом селена у наших пациентов с циррозом печени.Поскольку концентрация селена в нашем исследовании не анализировалась, важность не может быть оценена в дальнейшем. Шкала Чайлда – Тюркотта – Пью является хорошо известной классификацией для оценки степени тяжести цирроза печени. Хотя мы не наблюдали положительного влияния добавок GSH на окислительный стресс или антиоксидантную способность у пациентов с циррозом печени, ценным выводом этого исследования было то, что наблюдались отрицательные ассоциации уровня GSH, соотношения GSH / GSSG, связанной с ним активности антиоксидантных ферментов. и шкала Чайлд-Тюркотта-Пью до, во время и после вмешательства у наших пациентов.Связь между GSH-статусом и тяжестью цирроза также наблюдалась в нашем предыдущем исследовании [46], а также в других исследованиях [3,4,19]. У пациентов с циррозом печени, в соответствии с тяжестью заболевания, увеличился оборот GSH и активность антиоксидантных ферментов, чтобы справиться с окислительным стрессом. Хотя мы не смогли дополнительно продемонстрировать использование пероральных добавок GSH в качестве эффективной альтернативной терапии для противодействия повреждению печени у пациентов с циррозом, для пациентов с циррозом печени все еще необходима стратегия увеличения или поддержания адекватных антиоксидантных возможностей, связанных с GSH.

Уникальность исследования заключается в пероральном применении GSH для пациентов с циррозом печени, который ранее не исследовался. Кроме того, мы выполнили последующее наблюдение (среднее время: 984 дня) после завершения вмешательства, где можно было изучить долгосрочное влияние добавок витамина B-6 и GSH на клинические исходы. Однако, поскольку мы потеряли 21 пациента для последующего наблюдения, уменьшение размера выборки может снизить статистическую мощность, чтобы не выявить значительного влияния витамина B-6 или GSH на окислительный стресс, антиоксидантную способность и клинические исходы.Вторым ограничением было отсутствие уровней GSH в тканях для дальнейшего обсуждения возможной динамической работы биосинтеза, потребления и обмена GSH при циррозе печени во время приема GSH. В-третьих, этиология цирроза в наших группах пациентов включала вирусное, алкогольное и криптогенное происхождение. Различное течение инсультов при повреждении печени может приводить к различным представлениям нарушенного статуса GSH. Последнее ограничение заключалось в использовании уровня MDA в качестве индикатора окислительного стресса, поскольку на уровень MDA могло повлиять продолжающееся повреждение печени.Однако соотношение GSH / GSSG использовалось в качестве вторичной меры окислительного стресса для подтверждения результатов.

Ингаляционный глутатион (GSH) по сравнению с плацебо при муковисцидозе — полный текст

150 подходящих пациентов будут включены в исследование на основе критериев включения. Пациенты будут разделены на две группы: 1) группа 1 возрастом от 6 до 18 лет; 2) Группа 2 старше 18 лет. Пациенты будут случайным образом распределены в группу лечения или плацебо. Пациенты, рандомизированные в группу GSH, будут получать дозу 10 мг / кг два раза в день в течение 12 месяцев.

Клинические посещения будут проводиться в начале (посещение 0, посещение для регистрации) и через один месяц (посещение 1), три месяца (посещение 2), шесть месяцев (посещение 3), девять месяцев (посещение 4) и двенадцать месяцев (посещение 5, окончание лечения).

Последующие клинические визиты будут проводиться через один месяц (визит 6), три месяца (визит 7), шесть месяцев (визит 8) после окончания лечения.

Во время визита 0 все подходящие пациенты будут вдыхать GSH (10 мг / кг), и динамическая спирометрия будет выполнена до, через 10 и 60 минут после ингаляции.