Кумыс из коровьего молока: Кумыс из коровьего молока (рецепт приготовления)

Содержание

Кумыс — пошаговый рецепт с фото

Приготовление кумыса:

1 готовим Кумыс – первое брожение.

Кумыс или, как его еще называли в 12 веке славяне, «млечное вино» не только очень вкусный напиток, но еще и полезный. Он дает организму много полезных витаминов и минералов, а также улучшает работу организма в целом. Есть слабый, средний и крепкий кумыс. Слабый напиток считается, когда его разливают в бутылки уже после его брожения до суток. Средний – это суточный кумыс. А вот Крепкий напиток выдерживают в холодном месте более недели. Поэтому необходимо внимательно отнестись к процессу его приготовления, так как и воздействовать на ваш организм он будет по-разному. Например, Слабый кумыс воздействует послабляюще на желудок, а Средний и Крепкий – замедляет перистальтику кишечника. Для начала нам необходимо вскипятить воду. В среднюю кастрюлю наливаем воду и ставим на большой огонь. Когда вода закипит, делаем средний огонь и кипятим жидкость еще 1 минуту.

После – выключаем конфорку и оставляем на некоторое время, чтобы вода стала комнатной температуры. Для приготовления этого напитка лучше использовать не просто молоко, а коровье парное. Татары, казахи и монголы готовят национальный напиток в деревянных или глиняных бочонках, но если под рукой у вас не нашлось таких емкостей, отличной заменой послужит и стеклянная банка. Итак, вливаем в нее молоко и кипяченую воду, обязательно придерживаясь пропорций (1 стакан воды на 3 стакана молока). Туда же добавляем кефир или простоквашу, мед или сахар и все хорошо перемешиваем столовой ложкой до полного растворения последнего компонента. Что касается сладкого компонента блюда! Предпочтительнее добавлять в Кумыс, конечно же, мед, так как напиток становится более ароматный и еще более полезный. Итак, накрываем банку марлей, чтобы в нашу смесь не попали другие предметы, например, мошкара и ставим в теплое место на
12-16 часов. Когда вы увидите на дне белый концентрированный осадок, первый этап брожения завершен! С помощью сита или через марлю процеживаем напиток в глубокую миску.

И потом снова переливаем его в бутылку, но уже без осадка.

2 готовим Кумыс – второе брожение.

Наливаем 100 мл воды в среднюю кастрюлю и подогреваем на среднем огне до теплого состояния. После этого переливаем ее в стакан и добавляем туда же дрожжи и одну чайную ложку сахара. Все хорошо перемешиваем ложкой и ставим в теплое место на 1-2 часа, чтобы дрожжи подошли. По истечению этого времени переливаем подошедшие дрожжи в бутылку с процеженной жидкостью. Закрываем тару плотно крышкой и снова ставим в теплое место на 18-20 часов. А после этого необходимо поставить Кумыс еще на 30-40 минут в теплое место, чтобы температура воздуха была 20-22°С. Для этого можно воспользоваться градусником, чтобы определить такое место, а в холодное время года можно ставить напиток возле батарей и около кухонной плиты.

3 подаем Кумыс.

А храним готовый напиток мы в холодильнике! Перед подачей его желательно подогреть до комнатной температуры.

Стаканчик такого чудо-напитка в день, и вы почувствуете прилив сил и бодрости. А наслаждаться Кумысом можно с выпечкой или мягкими булочками. Также он послужит прекрасным освежающим напитком в жаркий летний день! Приятного вам аппетита!

Советы к рецепту

– – Для приготовления Кумыса используйте только свежие дрожжи. Также отлично подойдут такие дрожжи, как пивные.

– – Кумыс – это не только освежающий напиток! В первую очередь это лечебная жидкость, которую часто используют при таких заболеваниях, как гастрит, неврастения, а также при сердечно-сосудистых заболеваниях и даже при туберкулезе. Нет каких-то явных противопоказаний для его употребления. Но если вас беспокоит здоровье, лучше, перед тем, как пить Кумыс в лечебных целях, проконсультироваться с вашим врачом.

– – Для приготовления Кумыса старайтесь выбрать менее жирное молоко, так как жир замедляет процессы брожения.

– – Внимание! Когда открываете банки с этим напитком, будьте очень осторожны. Так как из-за скопления газов в емкости, тару может разорвать.

– – Маленький секрет! Кумыс – это еще и антипохмелин. Поэтому после застолья на утро можно выпить стаканчик этого напитка.

Кумыс из коровьего молока — калорийность, полезные свойства, польза и вред, описание

Калории, ккал:

Углеводы, г:

6.3

Степные народы не знают лучшего напитка, чем кумыс. Пенистый, кисловато-сладкий, он для них является непременным элементом жизни. В сознании европейца кумыс является напитком кочевников. Но ещё греки его пили и готовили из молока коров.

Калорийность кумыса из коровьего молока

Калорийность кумыса из коровьего молока составляет 41 ккал на 100 грамм продукта.

Состав и полезные свойства кумыса из коровьего молока

Кумыс создан для пользы. В его составе можно найти минералы в большом количестве: магний и железо, калий и кальций. Чуть меньше фосфора. Витаминов в нём в десять раз больше, чем в молоке, это витамины: C, B1, B2 (calorizator). В лёгком кумысе можно обнаружить до 2% спирта.

Такой напиток просто необходимо принимать тем, у кого проблемы с почками, печенью, диабетом и анемией. Принесёт здоровье кумыс и будущим мамам, и молодым кормящим девушкам.

Кумыс – рецепт

Кумыс, рецепт приготовления которого будет представлен ниже, является одним из самых освежающих напитков, который можно приготовить в любое время года.

Кумыс из козьего молока – рецепт

Ингредиенты:

молоко козье – 1 л;
вода – 1л;
сахарный песок – 3 ч. ложки;
дрожжи – 5 г;
кефир – 3 ст. ложки.

Приготовление

Молоко необходимо вскипятить в алюминиевой посуде, после чего добавить в него сахар с водой и тщательно все перемешать. Получившаяся масса должна остыть до комнатной температуры.

Когда молоко остынет, следует добавить к нему кефир и убрать массу в теплое место на 10-12 часов. Прокисшее молоко нужно размешать и процедить. Если вы не боитесь комочков, прокисшую смесь можно не процеживать.

Теперь необходимо развести дрожжи с ½ ч. л. сахара в теплой воде и дать им 5 минут настояться. После этого дрожжи следует добавить в молочную смесь и тщательно ее перемешать. Полученный напиток необходимо разлить по пластиковым бутылкам, плотно закрыть и дать кумысу несколько часов настояться. Когда дрожжи «успокоятся», а произойдет это через 2-3 часа, напиток можно подавать к столу.

Кумыс из коровьего молока – рецепт

Ингредиенты:

молоко коровье – 1 л;
сахар – 3 ч. ложки;
вода – 1 л;
дрожжи – 5 г;
кефир – 2 ст. ложки.

Приготовление

Рецепт приготовления кумыса из коровьего молока практически не отличается от предыдущего, за исключением лишь исходного набора ингредиентов. Поэтому описанные ранее действия можно повторить для приготовления этого рецепта.

Готовый кумыс можно хранить в холодильнике несколько дней, однако, чем больше времени проходит, тем крепче становится напиток.

Приготовленный в домашних условиях кумыс также можно использовать в качестве ингредиента для выпечки кексов, пирогов или печенья. А преимущество такого напитка заключается в том, что он может быть приготовлен в любое время года.

В домашних условиях также можно приготовить топленое молоко и простоквашу. Непременно попробуйте!

Кумыс из коровьего молока из кобыльего молока

Кумыс — напиток, широко распространенный в некоторых районах Западной Сибири и юго-восточной части СССР, известен уже много столетий. Он готовится из кобыльего молока посредством прибавления закваски, вызывающей брожение, или чистых культур микробов (болгарская палочка и дрожжи). Кумыс приготовляется трех видов слабый, средний и крепкий. Распад лактозы и белка протекает в том же направлении, как и при получении кефира но так как брожение ведется при более высокой температуре и кобылье молоко содержит больше лактозы, чем молоко коровье, то понятно, что кумыс содержит больше молочной кислоты, чем кефир.

[c.487]
Очень большое значение имеют в и т а м и н ы А, С и группы В, содержащиеся в молоке, так как молоко является единственным источником витаминов в период кормления ребенка грудью. Следует также подчеркнуть, что молоко содержит очень небольшие количества витаминов D и Е. Содержание витаминов (А, группы В, С и др.) в молоке может, однако, сильно меняться в зависимости от характера и состава пищи матери и ряда других условий (пребывание матери на солнце, состояние ее здоровья и т. п. см. главу Витамины ). Значительное количество витамина С содержится в кобыльем молоке и соответственно в кумысе. Так, если в женском молоке содержится 3—6 мг% витамина С (в 3—6 раз больше, чем в коровьем), то в кобыльем молоке обнаружено до 33 мг%, а в кумысе — до 25 мг% витамина С. По-видимому, лечебное действие кумыса в значительной степени связано с большим содержанием в нем витамина С.
[c.487]

Кумыс. Кумыс — кисломолочный напиток из кобыльего или коровьего молока смешанного (молочнбкислого и спиртового) брожения, По химическому составу кобылье молоко значительно отличается от коровьего.

Оно беднее казеином, зато богаче альбумином, лактозоЙ4 витаминами С, В], В2 и микроэлементами (кобальтом, й [c.232]

Кумыс из коровьего молока своими руками — Сделай сам – портал самодельщиков

Вопрос В. Полякова, Московская область.

Очень интересуюсь рецептом изготовления кумыса из коровьего молока. Тридцать лет назад такой вот кумыс спас меня от тяжелого заболевания желудка. Сейчас опять потребовался этот кумыс, а рецепт потерян.

Кумыс из коровьего молока обладает такими же лечебными свойствами, как и кумыс из кобыльего молока. Готовят «коровий» кумыс из пастеризованного молока, сквашивая (сбраживая) его смесью молочнокислых бактерий (болгарские и ацидофильные палочки) и молочных дрожжей. Благодаря такой закваске в молоке осуществляется как молочнокислое, так и спиртовое брожение. Так что в кумысе содержатся и спирт, и молочная кислота, и углекислая кислота, а также накапливаются витамины группы В. Белок в этом молочном продукте находится в виде мелких хлопьев и поэтому хорошо усваивается организмом. Богат кумыс и минеральными солями. Напиток слегка пенится, имеет освежающий вкус и приятную кислотность.
Кумыс полезен и взрослым, и детям. Особенно рекомендуют его врачи людям, больным туберкулезом, хроническим бронхитом, фурункулезом, а также при истощении.
Для закваски берут 0,5 л свежего молока и кипятят его, после чего выдерживают в течение 15…20 минут при температуре 90…95°С (пастеризуют). Затем молоко охлаждают до 30°С, вносят в него бактериальную закваску, полученную из молочной лаборатории, и размешивают смесь чистым, выдержанным в кипятке венчиком до образования обильной пены. Закрыв сосуд с закваской крышкой, его оставляют на 8…20 ч при температуре 30°С. Когда в кастрюле образуется сгусток, его трижды размешивают (по 10 минут через каждый час). Готовую закваску хранят в холодильнике при температуре 5…7°С.
Молоко для кумыса лучше всего взять частично обезжиренное (половина цельного молока и половина обрата). В такое молоко, налитое в эмалированную кастрюлю, добавляют сахарный песок из расчета три чайные ложки на 1 л молока, доводят молоко до кипения и охлаждают до 30°С. В охлажденное молоко вносят кумысную закваску (или хороший кумыс предыдущих выработок) и тщательно все перемешивают 10…15 минут, добиваясь образования обильной пены. На 1 л молока требуется 100 мл (полстакана) закваски. Кастрюлю с заквашенным молоком закрывают крышкой и выдерживают при температуре 30°С 6…8 ч. Когда образуется сгусток, его вновь размешивают в течение 10…15 минут, после чего кумыс охлаждают до 16…18°С.
Кумыс через воронку разливают в бутылки с узким горлом и ставят в холодильник для созревания на двое…трое суток. Бутылку следует плотно закупорить пробкой, обернуть горлышко марлей и обвязать бечевкой. Хранят кумыс в холодильнике не более 3…5 дней. Перед употреблением его слегка взбалтывают.
Обязательной технологической операцией приготовления кумыса является перемешивание среды в процессе сквашивания.
***
Кумыс, приготовленный из коровьего молока, представляет собой хорошо диспергированный продукт, в котором даже в условиях длительного хранения не наблюдается процессов расслоения.
По своему составу, органолептическим и физико-химическим показателям он приближается к кумысу, приготовленному из кобыльего молока, а по содержанию отдельных витаминов и незаменимых аминокислот даже превосходит его.

Кумыс из коровьего молока начали производить в Кызылординской области

В Шиелийском районе Кызылординской области впервые в Казахстане начали производить кумыс из коровьего молока, передает корреспондент «Хабар 24». Особый вид напитка, придуманный технологом Баян Дуйсенбек, исследован в Национальном центре биотехнологии и Аграрном университете Алматы.

Биотехнолог по профессии Баян Дуйсенбек из Шиелийского района ежедневно изучает содержание молока в специальной лаборатории цеха. Она в поиске новых молочных продуктов питания. В прошлом году Баян по особой технологии переработки придумала, как производить мороженое из верблюжьего молока, а теперь приступила к производству кумыса из коровьего молока.

Баян Дуйсенбек, технолог:

— Используя сыворотку из коровьего молока, мы выпускаем кумысный напиток. Его вкус, химический и биологический состав практически ничем не отличается от кобыльего молока. Но главное, что напиток очень полезен для здоровья человека.

В цехе перерабатывается около трех тонн коровьего молока в день. Из него выделяется около тонны сыворотки. Именно из нее изготавливается питательный напиток. Так Баян применила в работе безотходное производство.

Баян Дуйсенбек, технолог:

— Мы специально с Национальным биотехнологическим центром в городе Алматы совместно с Аграрным университетом провели исследования по созданию кумысного напитка. До сих пор изучаем, после завершения работ поставим производство на широкие рельсы.

Большие новости маленького цеха послужили основой для будущих крупных бизнес-проектов.

Сабыр Ермаханов, предприниматель:

— В 2016 году мы организовали сельскохозяйственный кооператив. В нем сначала было 10 членов, в настоящее время – 35. Всего работой обеспечено 80 человек, выращиваем 750 верблюдов, 485 коров, 150 лошадей. Так как продукция чистая, спрос на нее высокий. Поэтому мы увеличиваем поголовье скота и объемы продукции.

Сегодня мини-предприятие выпускает 10 видов молочной продукции. Среди них – шубат, айран, мороженое, творог, курт, детский йогурт. Но Баян Дуйсенбек планирует расширить производство и рынок сбыта.

Авторы: Алибек Байшуленов, Канат Енсебаев, Айтмухамбет Байдулдаев.

Может ли быть кумыс из коровьего молока?

«Недавно приобрел в магазине напиток под названием «Кумыс». Правда, с добавлением: NEW product. На этикетке значилось: «Кисломолочный напиток на основе кумысной закваски из кобыльего молока». Надпись на обратной стороне бутылки гласила: «Напиток кисломолочный кумысный из коровьего молока». Имеет ли право производитель называть свой товар кумысом, ведь это совершенно определенный продукт, не имеющий отношения к корове?

Сергей Дорошенко, томич»

Людмила ПОПОВА, юрисконсульт

Отвечает Людмила ПОПОВА, юрисконсульт консультационного центра для потребителей ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Томской области»

– В традиционном понимании кумыс ассоциируется у нас с кобыльим молоком. И это оправданно, поскольку кумыс представляет собой кисломолочный продукт, изготовленный путем с

мешанного (кисломолочного и спиртового) брожения и сквашивания кобыльего молока с использованием заквасочных микроорганизмов. Его производство регулирует ГОСТ 52974-2008 «Кумыс. Технические условия». Производитель кумыса на этикетке своего продукта должен отразить вышеуказанные стандарты, которым он соответствует.

Применительно к рассматриваемой ситуации производитель указал на соответствие не национальным стандартам, предъявляемым к производству кумыса, а техническим условиям (ТУ). И тем самым он изначально обратил наше внимание, что не следует быть слишком требовательным к представленному напитку и искать в нем «тот самый» кумыс, поскольку это совершенно иной продукт, изготовленный из другого сырья.

Кроме того, само название этого продукта несколько усложнено, это вовсе не кумыс, а «NEW product КУМЫС».

В настоящее время подобные аналогии очень распространены, в том числе в сфере кондитерского производства. Так, например, есть конфеты «Метелица», а есть «Тетушка Метел

ица», и мы не можем от последних требовать полного соответствия первым. Есть конфеты «Маска» и «Маска ночи», «Кара-Кум» и «Короли пустыни» и т.д. Список может быть длинным.

Поэтому сообщение на этикетке «NEW product КУМЫС» о том, что он изготовлен на основе кумысной закваски из кобыльего молока, нисколько не искажает действительности, поскольку далее говорится о том, что основа напитка все же коровье молоко. И именно поэтому продукт не мог быть назван просто кумысом, а потребовалось столь замысловатое «NEW product КУМЫС».

Соглашусь, подобный подход к производству продуктов с кажущимся, на первый взгляд, знакомым названием нередко может ввести нас в заблуждение. Однако при более внимательном рассмотрении мы можем обнаружить, что это несколько не то, чего мы ожидаем. Но от ошибок никто не застрахован…

Кумыс — обзор | Темы ScienceDirect

Изоляция молочных продуктов

Можно ожидать, что почти все молочные продукты, произведенные из коровьего, козьего, кобыльего и овечьего молока, включая сливки, масло, сыр и йогурт, будут содержать Y. lipolytica (Таблица 1) . Эти дрожжи распространены в сыром молоке, растут на казеине при температуре холодильника, хотя их протеолитическая и липолитическая активность ниже при пониженных температурах. Штаммы Y. lipolytica , выделенные из сливочного масла, обычно обладают способностью расти на N -ацетилглюкозамине, глюконовой кислоте и сорбите; эти характеристики, по-видимому, коррелируют с источником напряжения. Если молоко содержит достаточное количество l-метионина, Y. lipolytica производит этанол, метионол (3- (метилтио) -1-пропанол) и другие ароматизирующие соединения.

Амаси (естественно ферментированное козье молоко из Зимбабве) и кумыс (естественно ферментированное кобылье молоко из Центральной Азии) обычно содержат Y. lipolytica , который расщепляет липиды и производит летучие органические соединения. Эти дрожжи также обычно содержатся в кефире (кисломолочном напитке из России, Восточной Европы и Центральной Азии).Присутствие Y. lipolytica в ферментированном молоке увеличивает выживаемость молочнокислой бактерии Lactobacillus rhamnosus . Давление 300 мПа снижает количество Y. lipolytica в ферментированном молоке, но это количество восстанавливается через 3 недели.

Около 15% образцов йогурта содержат Y. lipolytica ; он несколько повышает стабильность культур Lactobacillus bulgaricus в йогурте, но со временем их количество уменьшается.

Большинство сыров являются основной средой обитания дрожжей. Yarrowia lipolytica — один из преобладающих видов дрожжей в сыре Гауда, Камамбер, Бри и голубом сыре, а также он часто встречается в большом количестве других мягких и твердых сыров. Для роста предпочитает аминокислоты; клетки также будут расти на молочной кислоте, вырабатываемой лактобациллами в сыре, но не на лактозе. Yarrowia lipolytica используется в заквасочных культурах с молочнокислыми бактериями и другими дрожжами для некоторых сортов сыра, таких как Чеддер. Это потому, что он производит очень много протеолитических и липолитических ферментов и имеет способность расти в присутствии высоких концентраций соли при низких температурах.Он производит этиловые эфиры олеиновой и пальмитиновой кислот, которые придают фруктовый вкус мягкому творогу. Смешанные культуры Y. lipolytica и двух других дрожжей создают аромат сыра Кантале, производя этанол, другие спирты и сложные эфиры. В датских сырах Y. lipolytica производит 4-метилтио-2-оксомасляную кислоту, метантиол, диметилдисульфид, диметилтрисульфид, 2-пентилфуран, гексилфуран, 2-пропанон, 2-бутанон и лимонен. Производство сульфидов увеличивается за счет NaCl. Yarrowia lipolytica может подавлять рост патогенной бактерии Listeria monocytogenes в мягких сырах, но бесклеточный экстракт штамма голубого сыра Y. lipolytica стимулирует рост бифидобактерий. FTIR-спектроскопический анализ и профили свободных жирных кислот использовались для сравнения влияния различных штаммов этого и других дрожжей на качество сыра во время созревания.

Некоторые штаммы Y. lipolytica производят пигменты, такие как меланины, при метаболизме l-тирозина.Орнитин, фенилаланин, тирозин и лизин декарбоксилируются до биогенных аминов путресцина, фенилэтиламина, тирамина и кадаверина соответственно, но гистидин, по-видимому, не превращается в общий аллерген, гистамин.

На поверхности сыра, в твороге или йогурте Y. lipolytica может ингибироваться пленкой сывороточного протеина, содержащей натамицин, или токсинами-убийцами дрожжей, производимыми D. hansenii . Этому ингибированию противодействуют сложные эфиры сахарозы и жирных кислот.

Хотя дрожжи, содержащиеся в сыре, могут отрицательно повлиять на здоровье пациентов с ослабленным иммунитетом, они должны быть безопасными для здоровых людей.

Пищевая и лечебная ценность.

495KOUMISS

Доро М. и Мартин-Россет В. 2002. Молочные животные: лошадь. В: Энциклопедия

молочных наук, ред. Х. Рогинский, Я. Fuquay, и P.F.Fox, 630–637.

Лондон: Academic Press.

Ха, С., Ленг, А.М.Г., Ман, Л. 2003.Кумыс и его лечебные свойства.

Китайский журнал китайской материальной медицины 28 (1): 11–14.

Hao, Y., Zhao, L., Zhang, H., Zhai, Z., Huang, Y., Liu, X., and Zhang, L. 2010.

Идентификация бактериального биоразнообразия в кумысе путем денатурирующего гель-электрофореза в гра-

и видоспецифической полимеразной цепной реакции.

Journal of Dairy Science 93 (5): 1926–1933.

Хо, Ю., Жун, Х.С.С., Ленг, А.М.Г. 2003. Исследование состава и молекул пищевых продуктов кумыса

.Животноводство Внутренней Монголии 6: 22–23.

Канбе, М. 1992. Традиционное кисломолочное производство в мире. В: Функции

Ферментированное молоко: вызовы наукам о здоровье, ред. Y. Nakazawa и

A. Hosono. Лондон: Прикладная наука Elsevier.

Левин М.А. 1998. Поедание лошадей: эволюционное значение бегемота —

лет. Античность 72: 90–100.

Litopoulou-Tzanetaki, E. and Tzanetakis, N. 2000. Ферментированное молоко. В:

Энциклопедия пищевой микробиологии, ред.Р. Робинсон, К. Батт и П. Патель,

774–805. Лондон: Эльзевьер.

Лозович С. 1995. Применение цельного и ферментированного кобыльего молока в медицине в России.

Журнал кисломолочных продуктов 30: 18–21.

Lv, J. и Wang, L. 2009. Биоактивные компоненты в кере и кумысе.

В: Биоактивные компоненты в молоке и молочных продуктах, под ред. Ю.В. Парк,

251–260. Эймс, ИА: Уайли-Блэквелл.

Malacarne, M., Martuzzi, F., Summer, A., and Mariani, P.2002. Белковый и

жирный состав кобыльего молока: некоторые замечания по питанию со ссылкой на

на человеческое и коровье молоко. Международный молочный журнал 12: 869–877.

Маркони, Э. и Панфили, Г. 1998. Химический состав и питательные свойства

свойств коммерческих продуктов из сухого кобыльего молока. Journal of Food

Состав и анализ 11: 178–187.

Montanari, G. и Grazia, L. 1997. Ферментирующие галактозу дрожжи как ферментирующие микроорганизмы

ферментирующие микроорганизмы в традиционном кумысе.Пищевая технология и

Биотехнология 35: 305–308.

Му, З. и Бай, Ю. 2003. Кобылье молоко. Сельскохозяйственный журнал Внутренней Монголии

Университет 24 (1): 116–120.

Орсков Е.Р. 1995. Взгляд путешественника на внешнюю Монголию. Перспективы сельского хозяйства

24: 127–129.

Salimei, E. 2011. Животные, производящие молочные продукты: осел. В: Энциклопедия

молочных наук, ред. J.W. Fuquay, P.F. Фокс и П.Л.Х. McSweeney,

Vol.№1, 365–373. Лондон: Эльзевьер.

Тамин, А.Ю. и Маршалл, В. 1984. Микробиология и технология ферментированного молока

. В: «Достижения микробиологии и биохимии сыра

и ферментированного молока», ред. F.L. Дэвис, Б.А. Закон, 118–122. Лондон:

Elsevier Applied Science.

Тамин, А.Ю. и Робинсон, Р. 1999. Йогурт: наука и технологии.

Кембридж: Woodhead Publishing Ltd.

Загружено [Анил Кумар Пуния] в 04:24, 26 сентября 2015 г.

Frontiers | Перспективное исследование микробиома кумыса методом метагеномического анализа на основе метода одноклеточной амплификации

Введение

Кумыс, также называемый на монгольском языке чиге, чиго, арраг или айраг, представляет собой тип традиционного кисломолочного продукта.Это была популярная еда в Монголии и Внутренней Монголии Китая на протяжении веков (Zhang and Zhang, 2011). Люди в этих регионах употребляли кумыс во время торжеств и жертвоприношений (Zhang and Zhang, 2011). Самая ранняя запись о производстве кумыса восходит к династии Хань (BC202-AD202). Этот продукт приобрел широкую популярность во времена династии Юань (1271–1368 нашей эры) (Zhang et al., 2010b). В настоящее время кумыс — обычная пища для местного населения Монголии и Внутренней Монголии, хотя лишь в некоторых из этих регионов он производится в промышленных масштабах.Кумыс не только богат питательными веществами, в том числе высоким содержанием незаменимых аминокислот и витаминов, но также, как полагают, облегчает широкий спектр заболеваний и полезен для послеоперационного ухода (Jagielski, 1877; Thompson, 1879).

Традиционно кумыс изготавливают в деревянных бочках, контейнерах из шкуры животных или урнах. Ферментация происходит естественным путем при температуре окружающей среды после добавления фильтрованного кобыльего молока в емкость со старым кумысом, который служит закваской (Zhang and Zhang, 2011). Кумыс является хорошим источником новых бактерий с биотехнологическим потенциалом (Zhang et al., 2010a; Pan et al., 2011). Поэтому представляет большой интерес изучить и сохранить как можно больше бактерий кумыса, связанных с брожением. В течение последних десятилетий был проведен ряд исследований по изучению бактериального сообщества кумыса (Wu et al., 2009; Hao et al., 2010), которые в основном изучались методами культуральной, молекулярной биологии и пиросеквенирования (Sun et al., др., 2010). Среди этих различных подходов метод на основе пиросеквенирования предоставил наиболее полный профиль микробиоты кумыса независимо от фенотипических признаков и проблем культивирования отдельных микробов.Однако спектр функциональных генов, кодируемых кумысными бактериями, и их ферментативная способность остаются плохо изученными, особенно для редких микробных популяций.

В настоящем исследовании использовался метод геномики единичных клеток для анализа бактериальных метагеномов 10 образцов кумыса, собранных в Монголии и Внутренней Монголии Китая. В текущей работе используются современные технологии для изучения бактериального разнообразия молочных продуктов. Наша работа продемонстрировала возможность обнаружения таксонов с низкой численностью населения с помощью подхода одноклеточной метагеномики.Обнадеживающие результаты будут способствовать развитию и применению новых подходов к решению проблем в традиционной области исследований.

Материалы и методы

Подготовка проб

Всего было отобрано 10 проб кумыса из Монголии (MG14, MG15, MG16, MG17 и MG18) и Внутренней Монголии Китая (NM17, NM18, NM19, NM20 и NM21) для исследования метагеномики. Образцы были собраны в асептических условиях и транспортировались в сухом льду.

Один миллилитр каждого образца был предварительно обработан в соответствии с методологией, описанной в Ward et al.(2013) с некоторыми модификациями. Вкратце, образцы размораживали на ледяной бане в течение 3–5 мин. После плавления образцы их подвергали центрифугированию на низкой скорости для удаления примесей и скоплений эукариотических клеток. Затем прокариотические клетки осаждали из сыворотки молока центрифугированием при 13000 × g в течение 15 мин. Осадки ресуспендировали в 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с 1% Triton X-100 и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C для лизиса любых оставшихся эукариотических клеток. Затем бактерии осаждали центрифугированием при 13000 × g в течение 15 минут и осадки повторно суспендировали в 500 мкл PBS.Наконец, этап центрифугирования повторяли еще раз, чтобы промыть бактериальные клетки.

Градиентное разбавление и многократное усиление смещения

Для обнаружения малочисленных бактерий бактериальную суспензию, полученную из каждого образца кумыса, последовательно разбавляли для последующей реакции амплификации. Количество клеток в каждом образце приблизительно оценивали под микроскопом (Nikon, Токио, Япония) с использованием камеры для подсчета клеток (Qiujing, Шанхай, Китай). Стадия разбавления продолжалась до тех пор, пока количество клеток в каждой бактериальной суспензии не достигло примерно 100. Множественную амплификацию замещения разведенных клеток выполняли с использованием набора REPLI-g Single Cell Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Построение библиотеки и секвенирование

Амплифицированную ДНК разрезали случайным образом и отбирали фрагменты размером примерно 500 п.н. После создания библиотеки для проверки качества библиотеки использовали PerkinElmer LabChip ^® GX Touch и StepOnePlus ^TM Real-Time PCR System.Наконец, считывания с парных концов 125 п.н. секвенировали на платформе Illumina HiSeq 2500 в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ данных

Проверка качества и фильтрация последовательности

Необработанные считывания, сгенерированные секвенатором, могут содержать искусственные считывания контаминации адаптера во время создания библиотеки. Таким образом, для получения высококачественного набора данных чистого чтения были выполнены три шага: (1) исключение операций чтения, вызванных загрязнением адаптера; (2) удаление считываний со средним баллом ниже показателя phred Q30, который считался самым низким порогом для высококачественной базы; (3) удаление прочтений со значительным превышением «N» (≥5% от показаний). Последующий анализ был основан на чистых данных. Кроме того, было рассчитано качество статистической базы, основанное на Q30 и содержании GC.

Сопоставления с геномом хозяина были выполнены для удаления посторонних последовательностей, происходящих от хозяина. Любые считывания, полученные от хозяина, отбрасывали перед дальнейшим сравнением с эталонными последовательностями генома бактерий (или вирусов). Для получения более точных результатов при выравнивании использовалась MEM-модель Берроуза-Уиллера (BWA) (версия 0.97a) (Li and Durbin, 2009).

Таксономическое присвоение и разнообразие

Веб-программа Metaphlan использовалась для таксономического отнесения к уровням родов и видов (Segata et al., 2012). Чтобы сравнить разнообразие видов в пределах и между образцами, мы проанализировали альфа- и бета-разнообразие с помощью пакета R.

Чтение сборки, прогнозирования генов и аннотации

Для получения более полной информации мы собрали разрезанные фрагменты в геном (контиги). Однако из-за присутствия нескольких видов, что является обычным в метагеномных образцах, мы улучшили метод сборки биоинформатического генома, обычно используемый для анализа отдельных видов, путем интеграции SPAdes (версия 3.6.2), внутренние скрипты и метагеномные базы данных (Zerbino, Birney, 2008; Nurk et al., 2013).

Программное обеспечение MetaGeneMark использовалось для предсказания генов собранных контигов (Noguchi et al., 2006). Избыточные гены удаляли с помощью CD-HIT с охватом 90 и 95% идентичности (Li and Godzik, 2006; Fu et al., 2012). Относительное количество генов определяли путем сопоставления считываний высококачественного секвенирования с каталогом генов с использованием той же процедуры. Анализ противоречий ниже по течению был основан на относительной численности генов.Аннотацию генов выполняли путем сопоставления высококачественных последовательностей с несколькими общедоступными базами данных (а именно, неизбыточная база данных NCBI, NR; кластеры ортологичных групп белков, COG; Киотская энциклопедия генов и геномов, KEGG) с использованием BLAST (Altschul et al. , 1997). Поиск домена был выполнен с помощью Interproscan (Mulder and Apweiler, 2008).

Номера последовательностей нуклеотидов

Данные о последовательностях, представленные в этом исследовании, были депонированы в базе данных SRA (номер доступаSRP083102).

Результаты

Экспериментальный дизайн и последовательность действий

Для обнаружения малочисленных бактерий в кумысе была использована методика одноклеточной амплификации для анализа метагеномов образцов. Три бактериальные суспензии, каждая из примерно 100 клеток, были получены из независимого образца кумыса путем серийного разведения. Всего было проанализировано 30 разбавленных суспензий. Каждому разбавленному образцу был присвоен другой код образца, то есть идентификационный номер образца, за которым следуют 1, 2 или 3, представляющие три отдельных разведения.Исходя из предпосылки, что некоторые редкие виды будут присутствовать в одном из разведений, была проведена многократная амплификация замещения клеток; и около 5 Гб данных было сгенерировано для каждой суспензии кумыса бактерий.

Всего было произведено 1 040 323 864 необработанных считывания из 10 образцов кумыса (всего 30 бактериальных суспензий). Среднее количество считываний для каждой суспензии из 100 клеток составляло 34 677 462 (дополнительная таблица S1). После обрезки и фильтрации неквалифицированных последовательностей мы получили 1 018 381 702 чистых чтения для всех образцов (дополнительная таблица S1).Значения индекса Шеннона, индекса Симпсона, индекса Chao1 и количества наблюдаемых видов (рисунки 1–4) показали, что большинство образцов кумыса обладают высоким бактериальным биоразнообразием. Кривые разнообразия Шеннона – Винера показали, что глубина последовательности была адекватной для всех выборок (рис. 1).

РИСУНОК 1. Кривые разрежения Шеннона, оценивающие микробное разнообразие образцов кумыса.

РИСУНОК 2. Кривые разрежения Симпсона, оценивающие микробное разнообразие образцов кумыса.

РИСУНОК 3. Кривые разрежения Chao1, оценивающие микробное разнообразие образцов кумыса.

РИСУНОК 4. Индекс разрежения наблюдаемых видов, оценивающий микробное разнообразие образцов кумыса.

Таксономическая аннотация

Последовательности высокого качества были отнесены к разным таксономическим уровням, чтобы сделать возможным углубленный анализ выборочных бактериальных сообществ.Ссылаясь на некоторые опубликованные исследования биоразнообразия кумыса (Wu et al., 2009; Hao et al., 2010; Sun et al., 2010), мы классифицировали известные и ранее не сообщавшиеся ассоциированные с кумысом бактерии как обычные и редкие таксоны, соответственно.

Последовательности высокого качества представляли 13 различных родов (рис. 5). Три из них имели среднюю относительную численность более 1%, в том числе Lactobacillus ( L .), Lactococcus и Streptococcus .В частности, Lactobacillus и Lactococcus были двумя наиболее многочисленными родами, обнаруженными в кумысе. Доля Lactobacillus в образцах колебалась от 52,72 до 99,96%. Два представителя этого рода, L. helveticus и L. kefiranofaciens , преобладали среди большинства образцов кумыса (рис. 6). Вид L. buchneri присутствовал в основном в монгольских пробах, тогда как Lactococcus lactis был обнаружен в большинстве проб независимо от региона отбора проб.

РИСУНОК 5. Тепловая карта, показывающая относительную численность бактерий, обнаруженных в образцах кумыса на уровне рода.

РИСУНОК 6. Тепловая карта, показывающая относительную численность бактерий, обнаруженных в образцах кумыса на уровне видов.

Метагеномная сборка, прогнозирование генов и функциональная аннотация

После сборки ридов длина сборки составила 614 392 623 п.н. Значения N50 для сборок варьировались от 5 596 до 35 200 п.н. (дополнительная таблица S2).Количество предсказанных генов в образцах кумыса варьировалось от 10 347 до 34 547, при средней длине от 647,82 до 985,33 п. н. (дополнительная таблица S3). Хотя эмпирический функциональный анализ генов выходил за рамки настоящего исследования, мы аннотировали бактериальные микробиомы кумыса с использованием баз данных COG и KEGG, которые предсказывали функцию генов в значительной степени на основе гомологии последовательностей.

Всего 545 совпадений в выводе аннотации показали высокую гомологию с генами утилизации лактозы (категория углеводов и метаболизма COG, G), и некоторые из них были расположены в одном контиге (таблица 1).

ТАБЛИЦА 1. Гены, связанные с метаболизмом лактозы, аннотированы в бактериальном метагеноме кумыса.

Некоторые другие последовательности могут кодировать предполагаемые гены в категории COG, относящейся к транспорту и метаболизму аминокислот (E), включая последовательности, соответствующие расщепляющим казеин протеиназам, системе Opp для захвата олигопептидов из 4-18 остатков и аминопептидазам (например, , лейциламинопептидаза, пептидилдипептидаза A, аминопептидаза N, пролиниминопептидаза и эндопептидаза). Хотя некоторые последовательности имеют большое сходство с аминотрансферазами, специфичными для аргинина, аспартата, метионина и изолейцина, было идентифицировано только одно существенное совпадение, которое соответствует предполагаемому домену класса I / класса II, полученному из S. macedonicus (IPR004839), содержащему аминотрансфераза, специфичная для тирозина и фенилаланина. Наконец, ряд последовательностей обладают высокой гомологией с аминокислотными лиазами, включая S-рибозилгомоцистеинлиазу, аргининосукцинатлиазу, аспартатаммиаклиазу, цистатионин гамма-лиазу, гистидинаммиаклиазу и O-ацетилгомосерин (тиол) -лиазу.

Обсуждение

Кумыс — популярный традиционный кисломолочный продукт в Монголии и Внутренней Монголии Китая. Хотя был проведен ряд исследований по изучению бактериального разнообразия кумыса, мало информации было получено относительно генетической способности микробиоты кумыса. Здесь мы применили метод одноклеточной амплификации для анализа бактериальных метагеномов кумыса, уделяя особое внимание малочисленной популяции бактерий.

Типичный метагеномический подход ранее применялся для описания микробиоты кумыса.Однако из-за высокой стоимости получения глубокой последовательности редкая популяция микробиоты в образцах часто не покрывается должным образом. Таким образом, как филогенные, так и функциональные метагеномы миноритарных бактерий остаются ограниченными. Наш метод одноклеточной амплификации включал серийное разведение образцов до суспензии из 100 клеток. Из-за небольшого количества клеток, присутствующих в разбавленных образцах кумыса, будет извлечено только ограниченное количество ДНК. На этапе амплификации увеличивалось количество материалов ДНК, подлежащих анализу, и, следовательно, облегчался метагеномный анализ образцов, содержащих незначительные количества ДНК.Одним из недостатков этого метода была сложность обеспечения того, чтобы последовательности каждого таксона были одинаково усилены в процессе; поэтому полученные здесь результаты могут отражать только относительное количество последовательностей, но не абсолютное количество идентифицированных таксонов или функциональных генов. Тем не менее, это мало повлияет на наш анализ, поскольку настоящее исследование отличается от других опубликованных работ тем, что фокусируется на популяции редких бактерий. Данные, полученные в результате этой работы, предоставляют дополнительную информацию для недостаточно представленного населения.Мы считаем, что настоящий подход подходит для будущего анализа разнообразия бактерий для различных типов экологической среды.

Бактериальная микробиота кумыса в основном состоит из молочнокислых бактерий (LAB) и некоторых уксуснокислых бактерий (Zhang and Zhang, 2011). Как и ожидалось, наш набор данных содержал в основном последовательности, представляющие LAB и уксуснокислые бактерии. Последовательности, соответствующие Lactobacillus helveticus , преобладали во всех образцах. Кроме того, последовательности, представляющие вид, L.kefiranofaciens. L. buchneri. L. kefiranofaciens. Enterococcus ( E .) casseliflavus. E. faecalis. E. faecium. Leuconostoc mesenteroides. Также были обнаружены Lactococcus lactis и Acetobacter pasteurianus . Идентификации последовательностей различных таксонов может быть недостаточно, чтобы показать жизнеспособность бактерий, тем не менее, это отражает бактериальное сообщество в какой-то момент процесса ферментации. Миямото и др. (2010) предполагает, что преобладание бактерий в конечных ферментированных продуктах связано с их устойчивостью к кислотному стрессу.Как правило, лактобациллы имеют более высокую кислотостойкость, чем лактококки, что может объяснить высокое относительное количество последовательностей лактобацилл, присутствующих в нашем наборе данных. С другой стороны, частая встречаемость в кумысе L. helveticus совпала с наблюдением доминирования последовательностей L. helveticus .

В нашем наборе данных некоторые последовательности соответствуют L. otakiensis , который является редким видом, который никогда не встречался в кумысах или других молочных нишах.Впервые этот вид был описан и выделен из несоленого травильного раствора, используемого при производстве сунки, традиционного японского маринада (Watanabe et al., 2009). Это было обнаружено с помощью профилирования полиморфизма длины амплифицированного фрагмента на основе гена rec A. С тех пор не сообщалось, что этот вид связан с другими пищевыми нишами. Таким образом, вполне вероятно, что эта бактерия принадлежит к автохтонной флоре солений. Однако мы не можем исключить возможность того, что он не был обнаружен просто из-за чувствительности использованного метода обнаружения. Lactobacillus otakiensis может продуцировать аминокислоты с d-разветвленной цепью, такие как d-лейцин, d-алло-изолейцин и d-валин (Doi et al., 2013). Он может быть использован для улучшения производственных характеристик некоторых ферментированных продуктов (Kato et al., 2011).

Наше исследование также идентифицировало последовательности, представляющие вид S. macedonicus , о котором никогда не сообщалось как о бактерии, связанной с кумысом. Вместо этого это закваска, присутствующая в греческих овечьих и козьих сырах (Георгалаки и др., 2000). Некоторые представители этого вида способны продуцировать экзополисахариды, бактериоцины (Vincent et al., 2001; Anastasiou et al., 2015) и гамма-аминомасляную кислоту (Franciosi et al., 2015). Несмотря на то, что этот вид часто выделяют из ферментированных продуктов, исходная ниша S. macedonicus вызывает споры (Guarcello et al., 2016). Лишь недавно Papadimitriou et al. (2015) идентифицировали приобретенную плазмиду pSMA198 из Lactococcus lactis . Плазмида, вероятно, была передана в результате наследственного генетического обмена в среде молочных продуктов, что указывает на молочное происхождение S.macedonicus (Papadimitriou et al., 2015). Аналогичен S. thermophilus. S. macedonicus тесно связан с комменсалами и условно-патогенными микроорганизмами комплекса S. bovis / S. equinus .

Идентификация последовательностей, представляющих вид Ruminococcus torques , была неожиданной, поскольку эта бактерия обычно находится в кишечной среде. Это нормальный микроб кишечника человека, который может разлагать олигосахариды муцина путем конститутивного производства секреторных гликозидаз (Hoskins et al., 1985). Недавние клинические данные показывают, что у детей с расстройствами аутистического спектра изменяется количество фекалий этого вида; однако его роль в расстройстве остается неясной (Wang et al., 2013).

Удивительно, но некоторые из последовательностей представляли потенциальные патогены. Например, Klebsiella pneumonia является условно-патогенным микроорганизмом человека, который обитает примерно в 40% кишечника человека и животных. Mycobacterium orygis , ранее называемая oryx bacillus, является членом комплекса Mycobacterium tuberculosis , который может вызывать туберкулез человека (Dawson et al., 2012). Эти два вида были обнаружены в сыром молоке, но не в кумысе. Следовательно, их присутствие может быть связано с загрязнением во время обычного производства кумыса, особенно в неасептических или малоасептических условиях манипуляции.

Бактериальный метаболизм играет важную роль в формировании характеристик и качества кумыса. Процессы на основе микробов, такие как липолиз и протеолиз, необходимы для синтеза ароматических и вкусовых соединений кумыса (Gesudu et al., 2016). Соответственно, бактериальный метагеном содержал последовательности, которые потенциально кодируют деградацию лактозы и протеолитические системы.В отличие от относительно простых катаболических путей лактозы, протеолитические системы LAB состоят из разнообразного набора ферментов (Chen et al., 2014). По сравнению с другими обнаруженными кумысными LAB, доминирующий вид L. helveticus характеризуется высокой протеолитической активностью (Zhang et al., 2015). Большинство LAB содержат только одну протеиназу клеточной оболочки, которая инициирует гидролиз казеина молока, тогда как L. helveticus содержит по крайней мере два из этих ферментов, а именно PrtH и Prth3 (Zhao et al., 2011). Таким образом, высокие доли последовательностей, соответствующих сильным протеолитическим видам L. helveticus и генам, связанным с протеолизом, могут быть связаны с относительно высоким содержанием пептидов и свободных аминокислот в кумысе.

Одной из трудностей при производстве кумыса в промышленных масштабах является контроль вкусовых ощущений, поскольку кумыс традиционно изготавливали путем естественного брожения. Таким образом, было трудно определить аромат и профиль ключевых ароматических компонентов, особенно в присутствии природных загрязнителей.Производство ключевых ароматических компонентов является результатом ферментативного и ферментативного разложения аминокислот, таких как аминокислоты с разветвленной цепью, метионин и ароматические аминокислоты (Ardo, 2006). Примеры ароматических компонентов включают альдегиды, органические кислоты и сложные эфиры, которые образуются трансаминазным (AT) путем (Helinck et al., 2004). Этот путь инициируется трансаминазой, которая катализирует превращение аминокислоты в соответствующую ей α-кетокислоту (Helinck et al., 2004). Некоторые последовательности в нашем наборе данных соответствуют предполагаемым аминотрансферазам с разветвленной цепью и ароматическим аминокислотам.В частности, мы обнаружили предполагаемую ароматическую аминокислоту аминотрансферазу I в контиге ассоциированного с кумысом вида S. macedonicus . Поскольку наша текущая работа аннотировала только микробиом in silico , наших данных недостаточно, чтобы показать, что эти идентифицированные последовательности генов действительно функционировали для производства вышеупомянутых ароматических соединений кумыса. Тем не менее, присутствие этих генов предполагает, что они являются некоторыми возможными кандидатами на такую ферментативную активность; тем не менее, для выяснения их точных функциональных ролей потребуются дальнейшие экспериментальные работы.

Кроме того, мы обнаружили последовательности, соответствующие другим путям превращения аминокислот, включая лиазы аминокислот и треонинальдолазу. Первый фермент катализирует превращение метионина в метантиол (Irmler et al., 2008), что приводит к образованию диметилдисульфида и диметилтрисульфида (Fernandez et al., 2000), тогда как последний катализирует превращение треонина в глицин и ацетальдегид. (Отт и др., 2000). Точно так же простое обнаружение этих последовательностей в микробиоме кумыса не может служить определенным доказательством их реальной биологической роли; в будущем потребуется экспериментальное подтверждение.

Заключение

В настоящем исследовании использовался модифицированный метод метагеномики для анализа бактериального микробиома образцов кумыса, собранных в Монголии и Внутренней Монголии Китая. Мы охарактеризовали как филогенные, так и функциональные метагеномы редких видов кумыса; и наш набор данных отражает характеристики, которые представляют интерес и потенциал для биотехнологии. Наше исследование впервые продемонстрировало возможность использования методов одноклеточной амплификации для выявления бактериальной микробиоты кумыса, а также микробных загрязнителей.Разработанные здесь методы могут быть использованы в будущих исследованиях для мониторинга изменений микробиома кумыса в процессе ферментации, уделяя особое внимание меньшинству микробной популяции. Кроме того, другие методы омики, такие как транскриптомика, метаболомика, могут быть объединены с текущим метагеномическим анализом для подтверждения функций и метаболической способности микробиома кумыса.

Технически следующим шагом в этой работе будет оптимизация текущего метода. Например, увеличивая разбавление образца перед амплификацией ДНК, можно повысить вероятность обнаружения редких и новых бактерий.С другой стороны, альтернативный метод секвенирования, который может генерировать длинные считывания, такой как одиночная молекула Pacific Biosciences, технология секвенирования в реальном времени, может использоваться для улучшения процесса сборки генома.

Взносы авторов

WZ и HZ разработали исследование. WZ, GY, JY и L-YK написали рукопись. QH, WH, WL, BM и TS проводили эксперименты. WZ и QH проанализировали данные. Все авторы рецензировали рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарность

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (грант № 31571815).

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2017.00165/full#supplementary-material

Список литературы

Альтшул, С. Ф., Мэдден, Т. Л., Шаффер, А. А., Чжан, Дж., Чжан, З., Миллер, В. и др. (1997). Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска по базам данных белков. Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402. DOI: 10.1093 / nar / 25.17.3389