Тополь м это что: «Тополь-М»: как Россия в 1990-е создавала сверхсовременную ракету

1. Уровни салицилата и катехола поддерживаются в трансгенном тополе nahG

   Автор (ы): Элисон М. Морс; Тимоти Дж. Чаплински; Кристофер Дервинис; Paula M. Pijut ; Эрик А. Шмельц; Венди Дэй; Джон М. Дэвис
   Дата: 2007
   Источник: Фитохимия.68: 2043-2052.
   Серия публикаций: Научный журнал (JRNL)
   Станция: Северная исследовательская станция
   PDF: Скачать публикацию (449,67 КБ)
   
   Описание Метаболический профиль был использован для исследования молекулярных фенотипов трансгенного Populus tremula × гибрида P. alba , экспрессирующего трансген nahG , бактериальный ген, кодирующий салицилатгидроксилазу, превращающую салициловую кислоту катехол.Несмотря на эффективность этого трансгенного подхода в снижении уровней салициловой кислоты в других модельных системах и, таким образом, в выяснении роли салициловой кислоты в передаче сигналов растений, трансгенные тополи имели аналогичные уровни салициловой кислоты и катехола в листве, что и у нетрансформированных контролей, и не проявляли морфологических фенотипов. . Чтобы получить более глубокое понимание основы этих наблюдений, мы проанализировали метаболические профили листьев, на которые влияет экспрессия трансгена. Экспрессия nahG уменьшала содержание конъюгатов хинной кислоты и повышала уровень глюкозида катехола, оказывая при этом незначительное влияние на уровни салициловой кислоты и катехола, субстрата и продукта, соответственно, фермента nahG .Это предполагает биологическую роль повышенных уровней конститутивной салициловой кислоты в Populus , в отличие от других систем растений, в которых nahG резко снижает уровни салициловой кислоты.
   Примечания к публикации
   • Посетите веб-сайт Северной исследовательской станции, чтобы запросить печатную копию этой публикации.
   • Наши онлайн-публикации сканируются и фиксируются с помощью Adobe Acrobat.
   • В процессе захвата могут возникнуть опечатки.
   • Пожалуйста, свяжитесь с Шэрон Хобрла, [email protected], если вы заметите какие-либо ошибки, которые делают эту публикацию непригодной для использования.
   • Мы рекомендуем вам также распечатать эту страницу и прикрепить ее к распечатке статьи, чтобы сохранить полную информацию о цитировании.
   • Эта статья была написана и подготовлена ​​государственными служащими США в официальное время и поэтому находится в открытом доступе.
   Цитирование Morse, Alison M .; Чаплински, Тимоти Дж .; Дервинис, Кристофер; Пиджут, Паула М.; Schmelz, Eric A .; День, Венди; Дэвис, Джон М. 2007. Уровни салицилата и катехола поддерживаются в трансгенном тополе nahG . Фитохимия. 68: 2043-2052.
   Ключевые слова Populus tremula × P. alba hybrid, salicaceae, фенольный гликозид, катехол, хинная кислота, салициловая кислота, салицилатгидроксилаза, nahG
   Связанный поиск

   ---

   XML: Просмотр XML

Показать больше

Показать меньше

https: // www.fs.usda.gov/treesearch/pubs/19137

Тополь Пероксиредоксин Q. Тиоредоксин-связанный хлоропластный антиоксидант, действующий в защите от патогенов

Реферат

Пероксиредоксины — это повсеместно встречающиеся тиоредоксин- или глутаредоксин-зависимые пероксидазы, функция которых заключается в разрушении пероксидов. Пероксиредоксин Q, один из четырех подтипов растений, является гомологом комиграционных белков бактериального бактериоферритина. Мы показываем здесь, что белок тополя ( Populus tremula x Populus tremuloides ) действует как мономер с внутримолекулярным дисульфидным мостиком между двумя консервативными цистеинами. Был протестирован широкий спектр электронодоноров и подложек. В отличие от пероксиредоксина типа II, пероксиредоксин Q не может использовать проверенные изоформы глутаредоксина или циклофилина, но различные цитозольные, хлоропластные и митохондриальные тиоредоксины являются эффективными донорами электронов без выраженной специфичности. Редокс-потенциал средней точки каталитического дисульфида пероксиредоксина Q составляет -325 мВ при pH 7,0, что объясняет, почему белок дикого типа восстанавливается тиоредоксином, а не глутаредоксином. Дополнительным доказательством того, что тиоредоксин служит донором, является образование гетеродимеров между пероксиредоксином Q и моноцистеиновыми мутантами тиоредоксина m шпината ( Spinacia oleracea ).Пероксиредоксин Q может восстанавливать различные алкилгидропероксиды, но с большей эффективностью для гидропероксида кумола, чем пероксид водорода и третичный бутилгидропероксид. Использование иммунолокализации и конструкции слияния с зеленым флуоресцентным белком указывает на то, что транзитная последовательность эффективно направляет пероксиредоксин Q в хлоропласты и особенно в замыкающие клетки. Экспрессия этого белка и пероксиредоксина типа II модифицируется в ответ на заражение двумя расами Melampsora larici-populina , возбудителя ржавчины тополя.В случае гиперчувствительного ответа экспрессия пероксиредоксина увеличивалась, тогда как при совместимом взаимодействии она снижалась.

Организмы, живущие в аэробных условиях, разработали ряд антиоксидантных систем для защиты клеток от окислительных повреждений, вызванных активным кислородом и активными формами азота. Возникающее семейство негемовых пероксидаз, называемых пероксиредоксинами (Prx), было описано во всех царствах в последние годы (Chae et al., 1994a, 1994b; Dietz et al., 2002). Эти повсеместно распространенные белки способны восстанавливать органические и неорганические гидропероксиды с помощью электронов, обеспечиваемых в основном NADPH или NADH и различными белками, такими как тиоредоксин (Trx), глутаредоксин (Grx), циклофилин A и субъединица F алкилгидропероксидредуктазы (Chae et al., 1994a; Niimura et al. , 1995; Lee et al., 2001; Rouhier et al., 2002a). В дополнение к их документально подтвержденной активности в качестве пероксидаз, Prx участвует в устойчивости к химически активным формам азота (Bryk et al., 2000; Wong et al., 2002; Сакамото и др., 2003). Prx сначала были классифицированы на два подкласса, 1-Cys Prx и 2-Cys Prx, в соответствии с количеством консервативных цистеинов. Однако возрастающее количество Prx, обнаруженное во всех организмах, требует более сложной иерархии. Существует по крайней мере шесть изоформ Prx у млекопитающих, пять — у дрожжей, и девять из 10 генов, присутствующих в геноме Arabidopsis, экспрессируются (Park et al., 2000; Dietz et al., 2002; Fujii and Ikeda, 2002; Брехелин и др., 2003).

Последовательности растений можно разделить на четыре отдельные подгруппы (Dietz et al., 2002; Rouhier and Jacquot, 2002d; Dietz, 2003). Первый соответствует 1-Cys Prx. Это ограниченные семенами ферменты, которые в основном локализованы в ядре эмбриона и слое алейронов (Stacy et al. , 1999). Вторая группа, которая включает димерный 2-Cys Prx, хорошо охарактеризована с точки зрения функции и каталитического механизма (Dietz et al., 2002; Goyer et al., 2002; Konig et al., 2002, 2003). Эти белки, гомологичные Prx I-IV млекопитающих и бактериальному AhpC, являются хлоропластическими ферментами.Третий класс — это большая группа мономерных Prx типа II, по крайней мере, с пятью экспрессируемыми изоформами у Arabidopsis (Brehelin et al., 2003). Предполагается, что два из них являются цитозольными ферментами, два других — хлоропластическими и митохондриальными (Choi et al., 1999; Rouhier et al., 2001; Horling et al., 2002). Наконец, последний класс — это Prx Q, фермент, гомологичный комиграционным белкам бактериоферритина (BCP). До недавнего времени считалось, что этот тип фермента присутствует только у прокариот и низших эукариот, но недавно был охарактеризован фермент Sedum lineare (Kong et al., 2000). По-видимому, этот фермент представляет собой мономер с внутримолекулярным дисульфидным мостиком между двумя остатками Cys, разделенными всего четырьмя аминокислотами (Kong et al. , 2000). Тем не менее, исследования мутагенеза BCP показывают, что этот белок функционирует только с каталитическим Cys (Jeong et al., 2000). Таким образом, эти результаты противоречивы и заслуживают дальнейшего исследования.

Более того, не очень хорошо изучены функции BCP и Prx Q. BCP участвует в устойчивости Escherichia coli к различным окислителям и сверхэкспрессируется у Frankia sp. при формировании симбиоза с Alnus glutinosa (Jeong et al., 2000; Hammad et al., 2001). У Arabidopsis, по-видимому, транскрипты Prx Q чувствительны к окислительно-восстановительным изменениям. Например, его синтезу способствует яркий свет и окислители, а его исчезновение усиливается восстановителями, такими как аскорбат (Horling et al., 2002, 2003). Физиологический донор электронов, а также клеточная и субклеточная локализация этого фермента в настоящее время неизвестны, хотя в недавнем протеомном исследовании было показано, что Prx Q удерживается из лизата хлоропластной стромы на колонке, содержащей моноцистеиновый мутант Trx m (Motohashi et al. , 2001). В данной работе основное внимание уделяется биохимическим свойствам Prx Q тополя ( Populus tremula x Populus tremuloides ) с акцентом на каталитический механизм и специфичность доноров электронов и субстратов. Кроме того, были исследованы клеточная и субклеточная локализация и функция этого фермента. Мы обнаружили, что Prx Q определенно является хлоропластным ферментом, о чем свидетельствует его N-концевое удлинение, и что он участвует в ответе на заражение тополя ржавчиной грибком Melampsora larici-populina .

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ последовательности

Выведенная аминокислотная последовательность исследуемого здесь фермента тополя состоит из 213 остатков с предполагаемым транзитным пептидом из 64 остатков, идентифицированных по аналогии со зрелым Prx Q S. lineare (Kong et al., 2000). Рекомбинантная зрелая форма Prx Q тополя, использованная в этом исследовании, содержит 151 аминокислоту, включая два остатка (один Met и один Ala), которые были добавлены к N-концу сразу после предполагаемого сайта расщепления предшественника. Его расчетная молекулярная масса и pI составляют 16 831 Да и 9,3 соответственно.

Сравнение аминокислотных последовательностей трех Prx Q растений и четырех BCP из цианобактерий, бактерий, дрожжей и архебактерий показано на рисунке 1. Все последовательности растений содержат N-концевое удлинение от 60 до 70 аминокислот, которое предполагается для быть последовательностью-мишенью хлоропласта с помощью программного обеспечения для прогнозирования (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ и http://psort.nibb.ac.jp/form.html). Фермент Saccharomyces cerevisiae также обладает N-концевым удлинением, но субклеточное расположение дрожжевого фермента еще не идентифицировано.Последовательности зрелых белков, лишенные транзитных пептидов, имеют длину от 149 до 156 аминокислот, и все они содержат два предполагаемых цистеина активного сайта в положениях 46 и 51 (тополь нумерация укороченной конструкции). Cys 46 — это остаток, гомологичный каталитическому Cys, присутствующему во всех пероксиредоксинах растений, независимо от их подтипа {консенсусная последовательность P- (X) ₃ -T- [P / F] — (X) -C- [T / S / P]} и участвует в катализе через кратковременное образование сульфеновой кислоты. Уровни идентичности последовательностей зрелых растительных белков колеблются от 84% до 88%. Сравнение между растительными и нерастительными ферментами показывает гораздо более низкие уровни идентичности, от 35% до 55%.

Выравнивание Prx Q тополя с гомологичными белками с помощью ClustalW. Номера доступа: AY530803 для тополя Prx Q (Pop trem), BAA _{для S. lineare (линия Sed), BAB01069 для Arabidopsis (Ara thal), NP 487223 для Nostoc sp.PCC 7120 (№ pcc7), NP 343463 для Sulfolobus solfataricus (Sul solf), P23480 для E. coli (Esc coli) и CAA86239 для S. cerevisiae (Sac cerevisiae). Стрелка представляет место усечения последовательности тополя.}

Биохимическая характеристика

Экспрессия, очистка и мутагенез

С помощью комбинации гель-фильтрации и катионообменной хроматографии рекомбинантные Prx Q WT, C46S и C51S очищали до гомогенности (рис. 2А). Общий выход составил примерно от 7 до 30 мг гомогенного белка L ^-1 из культуры E. coli . Окисленная форма очищенного Prx Q дикого типа (WT) представляет собой мономерный фермент, о чем судят по его поведению во время гель-фильтрации (данные не показаны) и его миграции в невосстанавливающем 15% (мас. / Об.) SDS-PAGE (фиг. 2A, дорожка 4). Два моноцистеиновых мутанта способны образовывать измеримые количества гомодимера, предположительно через дисульфидные связи с участием оставшегося Cys (рис. 2A, дорожки 5 и 6). Титрование тиолов восстановленных ферментов подтвердило присутствие двух тиолов m ^-1 фермента для восстановленной формы WT Prx Q, тогда как тиолы не могли быть обнаружены в окисленном состоянии (данные не показаны).Это наблюдение предполагает, что в мономере присутствует внутримолекулярный дисульфид. Только один Cys был обнаружен в ферменте ^-1 для двух мутантов (данные не показаны).

A, SDS-PAGE (15%, мас. / Об.) Анализ рекомбинантных белков Prx Q. Тополь Prx Q WT (дорожки 1 и 4), Prx Q C46S (дорожки 2 и 5) и Prx Q C51S (дорожки 3 и 6) в восстанавливающих условиях (10 мм DTT [дитиотрейтол], дорожки 1-3) и в невосстанавливающих условиях. условия (полосы 4-6).B: невосстанавливающий SDS-PAGE, показывающий образование гетеродимеров между Prx Q C51S и Trx m C40S. Дорожка 1, Prx Q C51S-TNB; дорожка 2, Prx Q C51S-TNB + Trx m C40S; переулок 3, Trx m C40S; дорожка 4, Prx Q C51S-TNB + Trx m C40S + 10 мм DTT. Звездочка представляет собой гетеродимер между Prx Q C51S и Trx m C40S, a и c являются соответственно мономером и димером Trx m C40S, а b и d представляют собой мономер и димер Prx Q C51S соответственно.

Донор электронов и специфичность субстрата

Независимо от используемых условий, мы не смогли наблюдать DTT, функционирующего как прямой донор электронов для Prx Q, с использованием метода обнаружения окисления железа в ксиленоловом оранжевом (FOX). Активность наблюдалась только в том случае, если Trx был добавлен для ускорения катализа (фиг. 3). Чтобы исследовать, проявляет ли фермент предпочтение к данному донору электронов, была изучена эффективность нескольких доноров хлоропластов, включая шпинат ( Spinacia oleracea ) Trx m и f и недавно описанный Chlamydomonas reinhardtii Trx y (Lemaire et al. др., 2003). Кроме того, один митохондриальный Trx (тополь Trx h3, E. Gelhaye, N. Rouhier, J. Gualberto, J. Gérard, M. Hirasawa, N.Наврот, П. Olsson, G. Wingsle, E. De Fay, D.B. Knaff, et al., Неопубликованные данные), два цитозольных Trx (Trx h2 и h4 тополя), циклофилин A и одна изоформа Grx также были протестированы в качестве доноров электронов. На рисунке 3 показано, что в отличие от Prx типа II, WT Prx Q не может использовать Grx в качестве донора электронов. Аналогичным образом, циклофилин А тополя, использованный в этом исследовании, был неэффективен в качестве донора. С другой стороны, все протестированные Trx были активны с кажущейся эффективностью порядка h2> y> h4> [m, f, h3]. Эксперименты, проведенные с различными концентрациями Trx, показали, что реакции обычно насыщаются при концентрациях Trx от 5 до 10 мкм.Эксперименты с использованием НАДФН-восстановления Trx h4 тополя, катализируемого НАДФН-тиоредоксинредуктазой (NTR) Arabidopsis, обеспечивают метод спектрофотометрического мониторинга Trx-зависимого восстановления гидропероксида Prx Q. Кинетические параметры, определенные таким образом, показаны в таблице I. Некоторые гидропероксиды могут использоваться в качестве субстратов для Prx Q в присутствии Trx h4. Реакции насыщаются при концентрации Trx примерно 6 мкм и K _m для Trx h4, лучший донор электронов составляет около 1.5 мкм. С точки зрения каталитической эффективности (т.е. k _cat K _m ^-1 ), предпочтительным субстратом является гидропероксид кумола (CUOOH), за которым следуют H ₂ O ₂ и t-BOOH, но только для восстановления H ₂ O ₂ физиологически релевантен.

Временной ход восстановления H ₂ O ₂ , опосредованного рекомбинантным WT Prx Q и различными Trx в присутствии DTT.□, Тополь Trx h3; ▪, тополь Trx h2; ▵, тополь Trx h4; ○, шпинат Trx m; •, шпинат Trx f; закрытые пастилки, Chlamydomonas reinhardtii Trx y; и закрытые треугольники, Grx тополя, циклофилин A или контроли: только DTT, минус Trx и минус Prx Q.

Каталитические параметры WT Prx Q по сравнению с различными гидропероксидами Эти параметры были определены путем наблюдения за окислением NADPH в присутствии 1 мкм WT Prx Q.Кажущийся K _m для различных гидропероксидов измеряли при насыщающих концентрациях Trx h4. K _m Prx Q для Trx h4 составляет 1,5 мкм.

Характеристика активного сайта с помощью сайт-направленного мутагенеза

На фиг. 4 показана пероксидазная активность WT Prx Q, Prx Q C46S или C51S с H ₂ O ₂ в качестве субстрата и в присутствии DTT и WT Grx, Grx C30S или Trx h2. Как отмечалось ранее, WT Prx Q уменьшается только на Trx h2 (рис.4, столбец 7), но не Grx (рис. 4, столбцы 1 и 4) даже при высокой концентрации (50 мкм). Мутант C46S не обладает какой-либо биохимической активностью, независимо от используемых восстановителей (Trx или Grx) или субстратов (H ₂ O ₂ , tBOOH или CUOOH) (рис. 4, столбцы 2, 5 и 8, и данные не показаны). С другой стороны, в то время как активность мутанта C51S не обнаруживается при низкой концентрации Trx (примерно 5 мкМ), ее можно частично устранить, увеличив концентрацию Trx до 50 мкМ (рис.4, столбец 9). Неожиданно этот мутант обладает пероксидазной активностью в присутствии WT Grx, но он слабо активен в отношении мутанта Grx C30S (рис. 4, столбцы 3 и 6). Эти результаты были подтверждены спектрофотометрически после окисления НАДФН в присутствии систем Trx или Grx (данные не показаны).

Trx- или Grx-зависимая пероксидазная активность Prx Q WT, C51S или C46S. Активность пероксидазы измеряли с помощью 500 мкм H ₂ O ₂ , 5 мкм WT Prx Q (столбцы 1, 4 и 7), Prx Q C46S (2, 5 и 8) или Prx Q C51S ( 3, 6 и 9), в присутствии 5 мм DTT с 50 мкм WT Grx (столбцы 1-3), Grx C30S (4-6) или Trx h2 WT (7-9).Активность прекращалась через 5 минут после добавления H ₂ O ₂ и выражалась как концентрация израсходованной H ₂ O ₂ за 5 минут. Каждый эксперимент повторяли трижды. Фоновые значения реакций составляют порядка 50 мкм.

Комплексное образование

Биохимические характеристики, описанные выше, были подтверждены установлением того, что гетеродимеры могут образовываться между донорами и Prx Q C51S.В соответствии с биохимическими результатами, циклофилин A не мог образовывать гетеродимеры с Prx Q (данные не показаны). С другой стороны, гетеродимеры присутствовали при смешивании Prx C51S и различных моноцистеиновых Trx: Trx f C49S, Trx h2 C42S (данные не показаны) или Trx m C40S (фиг. 2B, дорожка 2). Диссоциация этого комплекса избытком DTT доказывает, что гетеродимер был связан ковалентным дисульфидным мостиком (рис. 2B, дорожка 4). Размер гетеродимерного полипептида (приблизительно 30 кДа) хорошо согласуется с добавлением одного Trx (13 кДа) к одному Prx Q (17 кДа).Эксперименты вестерн-блоттинга с антителами, направленными против Trx h2 и Prx Q тополя, подтвердили природу этой дополнительной полосы (данные не показаны). Наблюдение за тем, что WT Grx не образует стабильных гетеродимеров с Prx Q C51S, хотя он способен поддерживать активность этого мутанта, согласуется с образованием временного межмолекулярного дисульфидного мостика, который впоследствии восстанавливается вторым активным центром Cys Grx. (данные не показаны). Grx C30S не образует димеры с Prx Q C51S, хотя он образует отличные гетеродимерные структуры с Prx типа II в соответствии с его более низкой каталитической эффективностью (Rouhier et al. , 2002а).

Редокс-потенциал

На рисунке 5 представлены результаты окислительно-восстановительного титрования дисульфида Prx Q в диапазоне pH от 5,5 до 10,5. Каждая точка представляет собой среднее значение по крайней мере двух определений, и средние отклонения показывают, что экспериментальная неопределенность в E _m составляет от 5 до 10 мВ. Титрование при всех значениях pH отлично подходит для уравнения Нернста для одной двухэлектронной окислительно-восстановительной пары.Хотя DTT не является донором во временной шкале, используемой для анализа FOX, он способен уменьшать дисульфидный мостик фермента при более длительных периодах инкубации. Титрование при трех различных общих концентрациях DTT в используемых окислительно-восстановительных буферах (1, 1,75 и 2,5 мм) и при двух разных временах восстановления окислительно-восстановительного равновесия (2 и 3 часа) давало идентичные кривые титрования (в пределах экспериментальных неопределенностей), как и ожидалось для титрования установленное окислительно-восстановительное равновесие. Значение E _м для дисульфида Prx Q при pH 7.0, определенное с помощью метода флуоресценции mBBr, составляет -325 ± 10 мВ (рис. 5А). График зависимости E _м от pH содержит две линейные области (рис. 5B). При значениях pH от 5,5 до 9,0 наклон составляет -59 мВ, единица pH ^-1 , значение, ожидаемое для процесса, в котором двухэлектронное восстановление сопровождается поглощением двух протонов (Chivers et al., 1997) . Между pH 9,0 и 10,5 наклон E _m в зависимости от pH составляет -29,5 мВ, единица pH ^-1 , что указывает на то, что двухэлектронное восстановление сопровождается поглощением только одного протона в этом диапазоне pH (Chivers и другие., 1997). Пересечение этих двух отрезков прямой линии соответствует pK _a пары кислота / основание с состоянием протонирования, которое связано с окислительно-восстановительным состоянием Prx Q (Chivers et al., 1997). Хотя самым простым объяснением этих данных является то, что более кислый активный центр Cys восстановленного Prx Q имеет значение pK _— , близкое к 9,0, одни только термодинамические измерения не могут определить действительную аминокислоту, участвующую в этом протоне с окислительно-восстановительной связью. поглощение.

Окислительно-восстановительные свойства Prx Q. A, Окислительно-восстановительное титрование Prx Q при pH 7,0. Каждая реакционная смесь содержала 100 мкг Prx Q в 1,0 мл 100 мМ буфера MOPS (pH 7,0), содержащего DTT при общей концентрации 2,5 мМ ( E _h регулировали путем изменения соотношения восстановленного: окисленного DTT). Перед добавлением монобромбимана (mBBr) образцы уравновешивали в течение 3,0 ч. B, Влияние pH на значение E _m Prx Q.Условия реакции были такими же, как в А, за исключением используемых буферов pH (см. «Материалы и методы»).

Экспрессия и локализация Prx Q

Локализация Prx Q

Было предпринято несколько экспериментов, направленных на изучение клеточной и субклеточной локализации Prx Q. Сначала был проведен эксперимент по временной экспрессии с использованием химерного белка, полученного путем слияния транзитного пептида Prx Q с зеленым флуоресцентным белком (GFP). После бомбардировки эпидермиса листа табака ( Nicotiana tabacum ) (который содержит эпидермальные клетки и лежащие в основе паренхиматозные фотосинтетические клетки) флуоресценция была обнаружена в хлоропластах клеток мезофилла (данные не показаны), а также в хлоропластах замыкающих клеток устьиц. (Рис.6, А3). Контрольные эксперименты, показывающие естественную флуоресценцию хлорофилла, показывают, что флуоресценция GFP совпадает с флуоресценцией хлоропластов (рис. 6, A2). Эти результаты показывают, что транзитная последовательность на N-конце зрелого Prx Q эффективно направляет белок в хлоропласты, особенно в замыкающие клетки устьиц.Во второй серии экспериментов полутонкие срезы листьев тополя инкубировали с очищенными антителами к Prx Q, и присутствие полипептида определяли с помощью антикроличьих антител, связанных с флуоресцеинизотиоцианатом. Как и выше в экспериментах с GFP, вторичная флуоресценция была обнаружена в хлоропластах клеток мезофилла (рис. 6B). Эксперименты по иммуноцитохимии показывают, что Prx Q присутствует в стромальной части хлоропластов, а также каким-то образом связан с мембранами тилакоидов в распределении, аналогичном тому, которое наблюдается для 2-Cys пероксиредоксина (рис. 6С; Konig et al., 2002).

A, Хлоропластная локализация слитого белка, содержащего N-концевую последовательность Prx, слитого с GFP. 1, Изображение устьиц Nicotiana benthamiana в видимом свете. Трансфицировалась только нижняя замыкающая клетка. 2, Автофлуоресценция хлорофилла (красный). 3, флуоресценция слитого белка (зеленый). 4, объединенные изображения. В. Иммунофлуоресцентное мечение Prx Q на поперечном срезе листа тополя.C, Мечение Prx Q иммунным золотом в хлоропласте клеток мезофилла из светлых листьев тополя.

Экспрессия Prx Q в необработанных растениях

Экспрессию prx Q в органах растений исследовали путем регистрации числа меток экспрессируемой последовательности (EST), кодирующих этот белок, среди всех EST тополя, присутствующих в базе данных GenBank. Только девять EST присутствуют из общего числа примерно 125000, что позволяет предположить, что ген транскрибируется на очень низких уровнях в листьях (четыре удара), коре (три удара), цветках (один удар) и молодой напряженной ксилеме (один удар). ).За содержанием Prx Q также следили на уровне белка в корнях, стеблях или листьях здоровых растений. На фигуре 7A показано, что полипептид Prx Q присутствует только в определяемых количествах в листьях, но не в стеблях или корнях.

Характер экспрессии Prx Q и Prx типа II тополя в органах растений или в ответ на заражение M. larici-populina. A, Вестерн-блоттинг, показывающий экспрессию Prx Q в листьях (L), стеблях (S) или корнях (R) и экспрессию Prx Q и Prx типа II во время несовместимой реакции между 0 и 72 часами (B) или совместимая реакция между 0 и 24 часами и 10 днями после заражения (C).

Экспрессия Prx Q и патогенный ответ

Совместимые или несовместимые реакции возникают в результате заражения листьев тополя расами ржавчинного гриба. M. larici-populina. Мы определили, что уровень Prx Q и полипептида Prx типа II заметно увеличивается со временем инфицирования в случае гиперчувствительного ответа (рис. 7B) с максимумом примерно через 24 часа. Напротив, в совместимой реакции содержание Prx Q и Prx типа II уменьшалось по мере развития инфекции (рис.7С). Через 10 дней заражения содержание Prx Q примерно равно содержанию до заражения. В неинфицированных листьях (контроль) относительное количество Prx типа II оставалось почти неизменным, а количество Prx Q, по-видимому, незначительно варьировалось в ответ на изменения света, как это наблюдалось для транскриптов prx Q в Arabidopsis.

ОБСУЖДЕНИЕ

Plant Prx, как и их аналоги из других биологических организмов, в настоящее время вызывают большой интерес из-за их задокументированной или иногда предполагаемой защитной роли при окислительном или нитрозативном стрессе.Два подтипа были тщательно изучены: хлоропластный димер 2-Cys Prx и Prx типа II. Меньше известно о 1-Cys Prx и Prx Q. Здесь мы представляем новые данные, касающиеся молекулярного механизма, субстратной и донорной специфичности, а также функции и локализации Prx Q in vivo в тополе, древесном виде.

Каталитический механизм

Используя рекомбинантную технологию и сайт-направленный мутагенез, мы идентифицировали активный сайт фермента тополя как внутримолекулярный дисульфид, который включает Cys 46 и Cys 51.На основании нескольких доказательств предполагается, что Cys 46 является каталитическим Cys. Во-первых, он находится в консервативном положении по отношению ко всем другим типам Prx, где, как было показано, он является пероксидатическим Cys. Во-вторых, мутант C46S неактивен, тогда как мутант C51S частично активен при высокой концентрации донора электронов. Мы предполагаем, что в WT-форме фермента регенерация Cys 46 включает временное образование дисульфида с Cys 51, который впоследствии восстанавливается Trx, но не Grx.В мутанте C51S сульфеновая кислота может быть восстановлена ​​непосредственно Trx или Grx. Эти данные для WT или мутанта Prx Q C51S изображены на схеме реакции, представленной на рисунке 8. Эти наблюдения согласуются с результатами, полученными для BCP из E. coli , для которого важен только эквивалент Cys 46. и два других цистеина BCP не требуются (Jeong et al., 2000). Полный анализ выравнивания BCP также согласуется с этим наблюдением. В то время как первый Cys полностью консервативен, второй не присутствует в BCP из Helicobacter pylori или Synechocystis sp .(инвентарные номера AAD05701 и BAA16704 соответственно). Хотя эксперименты с сайт-направленным мутагенезом, проведенные с ферментом S. lineare , были интерпретированы с точки зрения двух основных цистеинов, эксперименты с использованием мутированного фермента S. lineare не исследовали возможность активности при высоких концентрациях Trx (Kong et al. др., 2000).

Схема реакции тополя Prx Q WT (A) и тополя Prx Q C51S или моноцистеинового BCP от других организмов (B).В случае Prx Q с двумя консервативными цистеинами (A) каталитический Cys трансформируется в промежуточный продукт сульфеновой кислоты, который восстанавливается под действием второго Cys с образованием внутримолекулярного дисульфидного мостика. Затем этот дисульфид восстанавливается Trx. В случае BCP только с одним консервативным Cys или в мутанте Prx Q C51S тополя (B) предполагается, что сульфеновая кислота восстанавливается непосредственно бицистеиновым Trx или Grx, образуя временный межмолекулярный дисульфидный мостик, который восстанавливается вторым Cys. Trx или Grx, эти доноры электронов окисляются.

Специфичность основания

На основе биохимического анализа Prx Q тополя мы обнаружили, что его каталитическая эффективность для восстановления H ₂ O ₂ (k _cat K _m ^-1 из 7.98 × 10 ³ m ^-1 с ^-1 ) сопоставимо со значением, полученным для E. coli BCP (2,45 × 10 ³ м ^-1 с ^-1 ) и со значением 2-Cys Prx из Arabidopsis (36 × 10 ³ m ^-1 s ^-1 ; Jeong et al., 2000; Konig et al., 2002). Помимо восстановления H ₂ O ₂ , Prx Q также катализирует восстановление нефизиологических пероксидов, с предпочтением CUOOH по сравнению с t-BOOH. Учитывая важную роль, постулируемую для H ₂ O ₂ , особенно в метаболизме хлоропластов, эти результаты, вероятно, имеют физиологическое значение.

Физиологический донор электронов

Хлоропласт фотосинтезирующих организмов представляет собой сложную органеллу, которая содержит множество белков с возможными аналогичными функциями.Помимо многих аскорбат или глутатионпероксидаз, в хлоропластах Arabidopsis также обнаружены четыре изоформы Prx: две димерные 2-Cys Prx, одна Prx типа II и одна Prx Q (Dietz et al., 2002). С другой стороны, большое количество изоформ Trx, вероятно, будет локализовано в этом отсеке: четыре Trx m, два Trx f, два Trx y, один Trx x и один индуцированный засухой хлоропластов белок 32 кДа (CDP32), тиоредоксин-подобный белок, который способен снижать 2-Cys Prx (Broin et al., 2002; Meyer et al., 2002). В более ранних исследованиях фермента S. linare использовалась пара редуктазы E. coli Trx / E. coli Trx в качестве донора электронов для реакции, которая не является физиологическим восстановителем (Kong et al., 2000). Мы провели обширное исследование электронодонорной специфичности Prx Q, протестировав большое количество хлоропластных и нехлоропластных тиоредоксинов. Хотя все протестированные Trx могли служить донорами электронов, их эффективность различалась. Наиболее эффективным восстановителем является цитозольный Trx, что предполагает отсутствие заметной специфичности между тиоредоксинами для восстановления этого фермента (рис.3). С другой стороны, две изоформы других задокументированных доноров, глутаредоксин и циклофилин A, совершенно неэффективны с WT Prx Q (Lee et al., 2001; Rouhier et al., 2002a). Тем не менее, др. Изоформы Grx или циклофилина, возможно, могут снижать WT Prx Q тополя. Это наблюдение четко отделяет Prx Q от Prx тополя типа II, который может использовать Trx и Grx в качестве доноров электронов (Rouhier et al., 2002a).

Как наблюдалось для димерного 2-Cys Prx, DTT не может служить прямым донором активности Prx Q, в отличие от его способности служить донором для Prx типа II (Horling et al. , 2003). Поскольку окислительно-восстановительный потенциал DTT достаточен для восстановления Prx Q (см. Ниже), это наблюдение предполагает важную роль активного центра Trx в распознавании белка / белка, необходимом для взаимодействия с каталитическим дисульфидом Prx Q. Хотя это будет Чтобы получить трехмерную структуру Prx Q, чтобы понять детальную природу этих молекулярных контактов, некоторое понимание дает недавно определенная структура гибридного белка из Haemophilus influenzae между модулями Prx и Grx (Kim et al., 2003). Взаимодействия между Prx и Grx происходят из заряженных взаимодействий между тремя остатками Asp в Prx в положениях 148, 154 и 156 и Lys и Arg в Grx, тогда как взаимодействия между Prx и Trx имеют гидрофобную природу. У тополя Prx типа II, который, как было ранее обнаружено, взаимодействует с Grx, обладает двумя остатками Glu, эквивалентными остаткам Asp в положениях 148 и 156, что частично объясняет взаимодействие (Rouhier et al., 2002a; Kim et al., 2003 ). При сравнении всех этих белков с Prx Q тополя мы можем наблюдать, что Prx Q обладает двумя остатками Glu (в положениях 200 и 205) в положениях, эквивалентных Asp148 и 154 слияния Prx / Grx, которые могут быть вовлечены в сходные электростатические взаимодействия.Эти наблюдения могут объяснить, почему Prx Q C51S способен взаимодействовать с Grx, но не почему дисульфидная связь WT Prx Q не восстанавливается каталитически с помощью Grx.

Чтобы оценить, существует ли термодинамический барьер для восстановления Prx Q с помощью Grx, мы провели обширную серию окислительно-восстановительного титрования Prx Q. Значение E _m составляет -325 мВ, измеренное для Prx Q при pH 7,0 объясняет, почему Grx со значением E _м при pH 7,0 между -200 и -230 мВ (Prinz et al., 1997) — такой плохой донор в этой реакции. Значение E _м для Prx Q тополя более отрицательное, чем у других пероксиредоксинов, которое варьируется от -320 мВ (2-Cys Prx B) до -288 мВ (Prx II B; Konig et al. , 2002) и уменьшение фермента тополя Trx было бы несколько неблагоприятным. Эта ситуация аналогична той, которая наблюдается для восстановления регуляторного дисульфида FBPase хлоропласта ( E _m , сообщалось о значениях -305 и -315 мВ для ферментов шпината и гороха [ Pisum sativum ] соответственно, тогда как E _m для гороха и шпината Trx f составляет -290 мВ) и снижение С-концевого регуляторного дисульфида НАДФ-малатдегидрогеназы сорго ( E _m -330 мВ) с помощью Trx m ( E _м -300 мВ; Schurmann and Jacquot, 2000).Несмотря на несколько неблагоприятные значения Δ E _m от 20 до 30 мВ, восстановление этих регуляторных дисульфидов может происходить эффективно, но гораздо большее значение Δ E _m примерно 100 мВ для снижения WT Prx Q с помощью Grx вероятно, слишком высока для продолжения реакции.

Экспрессия и локализация Prx Q

У незараженных и нестрессированных растений Prx Q экспрессируется только в листьях, но не в корнях или стеблях, и уровень экспрессии очень низок. Клеточное и субклеточное распределение Prx Q в листьях было исследовано с помощью иммунофлуоресценции, мечения иммунным золотом или слитых белков GFP. Все методы дали сходные результаты, указывающие на то, что белок локализован в хлоропластах клеток мезофилла, а также в таковых замыкающих клеток устьиц. Это наблюдение хорошо согласуется с прогнозами, сделанными на основе анализа транзитной последовательности. Поскольку известно, что H ₂ O ₂ является соединением, которое влияет на закрытие устьиц, вмешательство Prx Q в этот процесс весьма вероятно (Zhang et al., 2001). Кроме того, патогенные атаки листьев очень часто включают колонизацию гриба через устьицу устьиц (Laurans and Pilate, 1999; Mendgen and Hahn, 2002).

Пероксиды и особенно H ₂ O ₂ участвуют в регулировании устойчивости к болезням на различных уровнях. H ₂ O ₂ оказывает прямое противомикробное действие и вызывает гиперчувствительный ответ у растений. Кроме того, это субстрат для окислительного сшивания материала клеточной стенки и диффузный сигнал, который индуцирует транскрипцию различных генов устойчивости (Mellersh et al., 2002). Каким бы ни был тип взаимодействия тополь / M. larici-populina (несовместимый или совместимый), гриб способен проникать в устьичные клетки (Laurans and Pilate, 1999). Будущее инфекции зависит от способности растения атаковать и уничтожить патоген. При несовместимой реакции растение не проявляет видимых симптомов на листе. Как и в случае с животными клетками, это включает гиперчувствительный ответ, который возникает в результате окислительного взрыва с образованием огромных количеств H ₂ O ₂ и оксида азота в инфицированных тканях (Levine et al., 1994; Delledonne et al., 2001). Таким образом, вероятно, что высокая сверхэкспрессия Prx Q и Prx типа II, наблюдаемая в этих условиях (фиг. 7B), связана с необходимостью поддерживать низкие концентрации пероксида за пределами участков инфекции и беречь неинфицированные клетки. С другой стороны, в совместимой реакции гриб берет верх, и поражения с урединиоспорами появляются на листьях примерно через 7 дней в контролируемых условиях. Во второй ситуации концентрации пероксида могут быть ниже, и необходимость в детоксикации, по-видимому, не так важна, что приводит к снижению содержания Prx Q или Prx типа II со временем (рис.7С). Было показано, что транскрипция Prx типа II в листьях перца ( Capsicum annum ) отвечает на добавление H ₂ O ₂ повышением уровней мРНК (Do et al., 2003). В этом исследовании листья перца также были инфицированы бактериями, оомицетами или грибами ( Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria, Phytophtora capsici или Colletotrichum gloeosporioides ) в совместимых и несовместимых реакциях. Во всех случаях уровни РНК-транскриптов значительно различались, и характер вариации зависел от природы патогена и типа инфекции.Настоящее исследование содержит дополнительную информацию к информации, представленной Do et al. (Do et al., 2003). Это показывает, что другая пероксидаза (Prx Q) демонстрирует аналогичное поведение и, кроме того, что колебания также наблюдаются на уровне белка. Таким образом, вероятно, что зафиксированная здесь избыточная или недостаточная экспрессия Prx Q и Prx типа II является частью обширной программы, которая включает несколько пероксидаз для борьбы с инфекциями патогенов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Тополь ( Populus tremula x Populus tremuloides ) Trx h2 WT и C42S, h3 WT, h4 WT и Grx WT или C30S очищали, как описано ранее (Behm and Jacquot, 2000; Gelhaye et al., 2002; Rouhier et al., 2002c, 2002b; Gelhaye et al., 2003). Arabidopsis NTR и WT и тиоредоксины m и f мутантного шпината ( Spinacia oleracea ) получали, как описано в Jacquot et al. (1994), Schurmann (1995), Capitani et al. (2000) и Балмер и Шюрманн (2001). Последовательность C. reinhardtii Trx y (CrTrx y) описана в Lemaire et al. (2003). Производство и очистка циклофилина А тополя будут описаны позже.

Клонирование Prx Q тополя и сайт-направленный мутагенез

Открытая рамка считывания Prx Q тополя, в которой была удалена нуклеотидная последовательность, кодирующая хлоропластный транзитный пептид, была клонирована с помощью ПЦР из библиотеки кДНК листьев тополя в экспрессионную плазмиду pET-3d между двумя сайтами рестрикции Nco I и Bam HI со следующими олигонуклеотидами: прямой олигонуклеотид 5’CCCCCCCATGGCTAAGGTAAACAAAGG-3 ‘; обратный олигонуклеотид 5 ‘-CCCGGATCCTCAAAGGCTTTGAAGTAGTTT-3’.Оба сайта рестрикции подчеркнуты. Эта конструкция стала возможной благодаря удалению транзитной последовательности до остатка Phe в положении 63 по сравнению со зрелым Prx Q Sedum lineare . Таким образом, рекомбинантный белок начинается с последовательности MAKVN. Мутация двух остатков Cys в положениях 46 и 51 на Ser была произведена с помощью PCR-опосредованного сайт-направленного мутагенеза с двумя комплементарными мутагенными праймерами. Мутагенные праймеры следующие: C46S прямой 5′-GATGAAACCCCTGGG A GCACCAAACAGGCCTG-3 ‘; C46S обратный 5’-CAGGCCTGTTTGGTGC T CCCAGGGGTTTCATC-3 ‘; C51S вперед 5’-GGGTGCACCAAACAGGCC A GTGCTTTTAGAGATTC-3 ‘; C51S обратный 5’-GAATCTCTAAAAGCAC T GGCCTGTTTGGTGCACCC-3 ‘.Мутагенные основания выделены жирным шрифтом. Природу каждой мутации проверяли секвенированием ДНК.

Экспрессия и очистка WT и мутанта Poplar Prx Q

Escherichia coli штамм BL21 (DE3) котрансформировали с помощью вспомогательной плазмиды pSBET и каждой из рекомбинантных плазмид (Schenk et al., 1995). Культуры 5 л клонов, устойчивых к ампициллину и канамицину, индуцировали 100 мкМ изопропил-β-d-тиогалактозида в течение 4 часов. Затем клетки собирали центрифугированием при 4 400 g и суспендировали в буфере A (30 мМ Na-ацетат, pH 5.5, 1 мМ EDTA и 200 мМ NaCl) в присутствии 5 мМ DTT. Бактерии лизировали ультразвуком в течение 5 мин. Затем экстракт осаждали при насыщении сульфатом аммония между 25% и 80% (мас. / Об.). Эту фракцию последовательно подвергали гель-фильтрационной хроматографии с использованием ACA 44, уравновешенного буфером A. После диализа против буфера A без NaCl образец наносили на колонку с карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенную тем же буфером. Белки элюировали градиентом NaCl от 0 до 0.4 мкм, а затем диализовали и концентрировали против буфера А без NaCl. Гомогенность белков оценивали с помощью 15% (мас. / Об.) SDS-PAGE.

Trx-связанная пероксидазная активность

Реакционная смесь (50 мкл) содержала 30 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 500 мкМ DTT, 1 мкМ Prx Q, и различные концентрации Trx или Grx в диапазоне от 1 до 50 мкМ. Реакцию запускали добавлением 500 мкМ H ₂ O ₂ . Через 3 мин 5 мкл смешивали с 495 мкл реагента FOX1 (Wolff, 1994).Затем измеряли оптическую плотность при 560 нм после 1 ч инкубации.

Пероксидазную активность Prx Q также измеряли путем окисления НАДФН при 340 нм в сочетании с тиоредоксин-восстанавливающей системой (Arabidopsis NTR / тополь Trx h4), которая служила донором электронов и H ₂ 0 ₂ , t- BOOH или CUOOH в качестве акцептора электронов в соответствии с процедурой, описанной ранее для Prx тополя типа II (Rouhier et al. , 2002a). Единственная небольшая модификация заключается в том, что реакцию проводили в 50 мМ K ⁺ / Na ⁺ фосфатный буфер, pH 7.0. Определение каталитических параметров осуществляли с 1 мкм Prx Q, варьируя концентрацию одного субстрата при насыщающих концентрациях другого субстрата (6 мкм Trx h4 или 200 мкм гидропероксида).

Образование гетеродимеров между Prx Q C51S и Trx m C40S или Trx f C49S

Образование гетеродимеров между Prx Q WT или C51S тополя и шпинатом Trx m C40S или Trx f C49S осуществляли путем дериватизации различных Prx Q с DTNB с образованием Prx Q-TNB, как описано для тиоредоксинредуктазы в Wang et al.(1996) или обработкой диамидом в присутствии доноров тополя (Trx h2 C42S, Grx C30S и циклофилин A), как в Rouhier et al. (2002a). Для обработки DTNB Prx Q восстанавливали с помощью 20 мМ DTT, подвергали диализу и затем подвергали реакции с 50-кратным избытком 5,5′-дитиобис-нитробензойной кислоты (DTNB). Затем смесь диализовали для удаления этого избытка. Эквимолярные концентрации Prx Q-TNB и восстановленных моноцистеиновых мутантов Trx или Grx или циклофилина A WT использовали для создания гетеродимеров в 30 мМ Трис-HCl, pH 7.0 и 1 мм EDTA. Затем смесь подвергали SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях.

Титрование тиолов

Пятьсот микрограммов Prx Q WT, C46S и C51S восстанавливали инкубацией с 10 мМ DTT в течение 30 минут при комнатной температуре, осаждали одним объемом 20% (мас. / Об.) Трихлоруксусной кислоты (TCA) и хранили на льду 30 мин. Смесь центрифугировали 10 мин при 13000 g и дважды промывали 2% (мас. / Об.) TCA.Осадок ресуспендировали в 30 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 1 мМ EDTA и 1% (мас. / Об.) SDS. Концентрацию оценивали с помощью УФ-спектрофотометрии ( _M = 13,490 м ^-1 см ^-1 ) перед добавлением DTNB до конечной концентрации 100 мкМ. После 1-часовой инкубации в темноте оптическую плотность считывали при 412 нм и оценивали содержание тиола, используя коэффициент молярной экстинкции 13 600 м ^-1 см ^-1 .

Определение окислительно-восстановительного потенциала

Окислительно-восстановительное титрование выполняли с использованием mBBr, как в Krimm et al.(1998). Prx Q в концентрации от 100 до 200 мкг / мл ^-1 (6-12 мкм) инкубировали в аликвотах по 500 мкл при определенных значениях E _h , полученных путем варьирования относительных количеств окисленного и восстановленного DTT (при общая концентрация ДТТ 2,5 мМ) в течение 3 ч. Для расчета значений E _h использовалось значение E _m , равное -330 мВ при pH 7,0 и значение 9,2 для pK _a более кислого тиола восстановленного DTT (ссылки приведены в Krimm. и другие., 1998). Были использованы следующие буферы: MES, pH 6,0, MOPS, pH от 6,5 до 7,5, Tricine, pH от 8,0 до 8,5, и бис / триспропан, pH выше 8,5. После уравновешивания образца Prx Q при определенных значениях E _h с помощью окислительно-восстановительных буферов DTT добавляли растворенный в ацетонитриле mBBr до конечной концентрации 10 мМ. После 20-минутной инкубации с mBBr Prx Q осаждали добавлением 500 мкл 20% (мас. / Об.) TCA. Полученный осадок белка, полученный центрифугированием, промывали и растворяли в 100 мМ трис-HCl буфере, pH 8.0 и 1% (мас. / Об.) SDS. Флуоресценцию этих образцов измеряли при 450 нм при возбуждении светом 380 нм с использованием спектрофлуориметра (Series 2 Luminsecence Spectrofluorimeter; Aminco-Bowman, Rochester, NY). Подбор данных выполняли, как описано ранее в Krimm et al. (1998).

Инфекция листьев, экстракция белка, очистка антител и вестерн-блоттинг

Populus x intermericana Растения «Бопре» выращивали в течение 12 недель в теплице из спящих черенков в горшках, содержащих смесь песка и торфа.Полностью разросшиеся листья отделяли и распыляли на их абаксиальную поверхность суспензию урединиоспор в водном агаре (0,1 г л ^-1 ), доведенную до 5000 урединиоспор на мл ^-1 , или водным агаром (контроль). Использовали два изолята M. larici-populina : 98AG31 (патотип 3-4-7) и 93ID6 (патотип 3-4), вирулентный и авирулентный, соответственно, на Beaupré (Miot et al., 1999). Затем инокулированные листья инкубировали с самой верхней абаксиальной поверхностью, плавая на деионизированной воде в чашках Петри, при 20 ° C и искусственном освещении в течение различной продолжительности от 1 часа до 10 дней.Четыреста миллиграммов листьев растирали пестиком в ступке на льду, а затем 4 мл буфера для экстракции (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА, 2,5 мг мл ^-1 PVP и 25 мМ β- меркаптоэтанол). Смесь дважды центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g и супернатант осаждали 80% (мас. / Об.) Ацетоном. Белки осаждали центрифугированием и промывали 80% (мас. / Об.) Ацетоном. Белки ресуспендировали в 125 мМ буфере Tris-HCl (pH 6,8), содержащем 20% (мас. / Об.) Глицерина, 2% (мас. / Об.) SDS, 5% (мас. / Об.) Β-меркаптоэтанола и 0.05% (мас. / Об.) Бромфенолового синего, и их концентрации определяли с использованием набора для реакции Брэдфорда (Bio-Rad, Hercules, CA). Экстракцию белка из необработанных листьев, стеблей и корней проводили, как описано в Rouhier et al. (2001). Поликлональные антитела, полученные у кроликов против Prx Q тополя, очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Prx Q Sepharose в соответствии с процедурой, описанной ранее (Rouhier et al., 2001). Вестерн-блоттинг выполняли с использованием поливинилидендифторидных мембран (Millipore, Bedford, MA) и набора Immune Star Goat Anti-Rabbit Detection (Bio-Rad).

Внутриклеточная локализация с помощью GFP Fusion

Для внутриклеточной локализации in vivo первые 195 п.н. кДНК Prx Q тополя, соответствующие N-концевой пре-последовательности (65 аминокислот), были клонированы в сайты Nco I и Bam HI pCK-GFP3A с использованием два следующих праймера: 5′-CCCATGGCTTCCATTTCTCTC-3 ‘и 5′-CCGGATCCTTGGCAAAAATGGTATTCTT-3’.

ПЦР-амплифицированный фрагмент был слит с GFP по сайту Bam HI, в результате был получен химерный белок, в котором транзитная последовательность Prx Q присутствует на стороне N-конца GFP и под контролем двойного промотора 35S (Menand и другие. , 1998). Клетки Nicotiana benthamiana трансфицировали путем бомбардировки листьев частицами вольфрама, покрытыми плазмидной ДНК, и изображения получали с помощью конфокального микроскопа (LSM510; Zeiss, Jena, Germany).

Иммунолокализация

Срезы 25 мм ² были вырезаны из разросшихся листьев двухмесячных растений тополя и фиксировались в течение 3 ч при 4 ° C в 4% (мас. / Об.) Параформальдегиде и 0,5% (об. / Об.) Глутаровом альдегиде в 0,1 м какодилатный буфер, pH 7.4. Затем образцы промывали 0,1 мкл какодилата, обрабатывали 2% (мас. / Об.) OsO ₄ , обезвоживали в увеличивающемся спирте и оксиде пропилена, заливали в Durcupan (Fluka, Buchs, Швейцария) и, наконец, полимеризовали при 56 ° C в течение 48 ч.

Для иммуноцитохимии ультратонкие срезы (70 нм) помещали на никелевые сетки 300 меш. Сетки плавали в течение 15 минут в 50 мм Gly, 50 мм растворе с трис-фосфатным буфером (TPBS), переносили на 30 минут в блокирующий раствор 1% (мас. / Об.) Бычьего сывороточного альбумина (BSA) в TPBS / BSA, а затем обрабатывали в течение ночи при 4 ° C очищенными кроличьими антителами против Prx Q (разведенными в 100 раз в TPBS / BSA).Этот шаг был пропущен для контрольных образцов. После отмывки срезы инкубировали в течение 2 ч в растворе 50 мМ трис-HCl-буфера, содержащего 0,05% (мас. / Об.) Полиэтиленгликоля с меченным золотом козьим антикроличьим иммуноглобулином G (10 нМ, разведение 1:20; Sigma, Святой Луи). После промывания срезы сушили и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Наблюдения проводились с помощью электронного микроскопа (ТЕМ 902; Zeiss).

Для гистохимического обнаружения Prx Q с использованием флуоресценции срезы толщиной 130 нм были покрыты поли-Lys (Sigma) на предметном стекле.Смолу растворяли путем инкубации с этанолом, насыщенным NaOH, в течение 20 мин, промывали 100% (мас. / Об.) Этанолом, а затем промывали 100% (мас. / Об.) Ацетоном. Слайды обрабатывали в течение 15 мин раствором TPBS, содержащим 50 мМ Gly, промывали TPBS и, наконец, обрабатывали TPBS / BSA в течение 2,5 ч перед инкубацией с очищенными кроличьими антителами против Prx Q в течение ночи (разбавленные в 100 раз). После промывания TPBS и TPBS / BSA слайды инкубировали в течение 2 часов со вторичными антителами, связанными с флуоресцеинизотиоцианатом, разведенным в 160 раз.Контрольные эксперименты проводились путем исключения первичных антител или тестирования преиммунной сыворотки. Предметные стекла промыли и поместили в TPBS, содержащий 50% (мас. / Об.) Глицерина. Срезы просматривали на эпифлуоресцентном микроскопе (Optiphot II; Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк, соединенный с ртутной лампой и фильтрами B2A), а изображения получали с помощью камеры (D1; Nikon).

(PDF) Распределение биомассы листьев тополя и динамика азота в системе пересечения тополь-ячмень на юге Онтарио, Канада

осенью 1993 и 1994 гг. Должна была иметь меньшее влияние на оборот N

вблизи ряда деревьев тополя в 1994 и 1995 гг.Однако результаты

предполагают обратное (рис. 1а, б).

Повышенная скорость нитрификации почвы в середине пропашных культур

наблюдалась летом (с июня по июль) 1993 г. для обоих экспериментов (рис. 1a,

b). В 1992 году оба поля были засеяны соей. Высокие показатели в 1993 году

могли быть результатом разложения корневых клубеньков и высвобождения азота

соевых бобов в 1992 году. Однако этот эффект был заметен только в течение первых

месяцев инкубации (с июня по июль).В течение второго месяца инкубации

средние скорости нитрификации вблизи ряда тополей (<2,5 м) составляли 44,3 мкг

N 100 г – 1 сухой почвы в день – 1 в первом эксперименте и 53 мкг N 100 г – 1. сухой грунт

сут – 1 во втором опыте. Значения нитрификации почвы в середине

пропашных культур (4–11 м) составили 11,96 мкг N на 100 г – 1 сухой почвы в сутки – 1 и 12 мкг N

100 г – 1 для сухой почвы в сутки – 1 соответственно. В течение сезона 1993 года (с

по октябрь) иммобилизация азота (данные не представлены) наблюдалась на

поле.Следовательно, вероятно, что влияние зернобобовых культур на катион нитрифици

сохранялось только до конца первого инкубационного периода.

Изменение содержания органического углерода в почве, наблюдаемое по полю, показано для

эксперимента 1 (Рисунок 2a) и эксперимента 2 (Рисунок 2b) для всех 3 лет. Органический углерод почвы

вблизи ряда тополей (<2,5 м) был примерно на 1% выше

, чем значения КПО, наблюдаемые в середине пропашной культуры (4–11 м) в обоих экспериментах

.Собранные листья тополя содержали приблизительно 40% углерода, и

из данных биомассы листьев тополя, представленных в Таблице 1, ~ 1000 кг C га – 1

добавляется в почву в пределах 2,5 м от ряда деревьев тополя ежегодно. Об увеличении почвенного органического вещества под кронами деревьев на

и положительном влиянии

видов деревьев для агролесоводства на повышение плодородия почвы хорошо известно

(Канг и др., 1990; Наир, 1993). Постепенное накопление органического углерода в почве на протяжении

в течение семи лет под воздействием черной акации (Robinia pseudoacacia L. ) agro-

о лесной системе также сообщалось в регионе Азад Кашмир в Пакистане

(Ахмед и др., 1996). Удаление биомассы листьев тополя в эксперименте 1

в течение осенних сезонов 1993 и 1994 годов или добавление биомассы листьев тополя

в течение того же периода времени в эксперименте 2 не привело к значительному изменению

общего пула SOC, близкого к значению рядка дерева (P <0,05) за исследуемый период

(рисунки 2а, б). Этого следовало ожидать, поскольку только 15–35% добавленных органических остатков

фактически включаются в постоянный органический пул (гумус)

(Brady, 1990).Следовательно, два года добавления или удаления вряд ли повлияют на

общий пул SOC рядом с рядом деревьев тополя.

Общая надземная биомасса (AGB) ячменя (зерна + солома) за все 3

года представлена ​​на Рисунке 3 для эксперимента 1. Среднее AGB ячменя близко к

ряд ​​деревьев тополя (<2,5 м) составлял 517 , 500 и 450 гм – 2 в 1993, 1994 и

1995, соответственно, по сравнению с AGB ячменя 491, 484 и 464 гм – 2 в

в середине пропашной культуры.Урожайность зерна будет около 35-40% от ячменя

AGB (D. Falk, личн. Комм., 1996) для сорта, использованного в этом исследовании (OAC

Kippen). Урожайность ячменя AGB в 1993 и 1994 годах была значительно (P <0,05)

выше в ряду с тополями по сравнению с серединой ряда

85

как вырастить тополь с ветки

Факты о тополе. Свяжите все низко свисающие ветки в день пересадки, чтобы предотвратить травму или поломку во время переезда.Выкопайте комок корня на 12 дюймов шире, чем при обрезке на шаге 1, используя острую лопату. Это руководство о том, как разводить тополь черенками. или дольше. Березы могут вырастать от 12,2 до 18,3 м (от 12 до 18 м) в высоту, с шириной навеса от 6,1 до 7,6 м (от 6 до 7 м). Дубовые желуди привлекают дикую природу. Отрежьте ветку длиной 3 фута (0,91 м) и диаметром 1 дюйм (2,5 см). Плюс тюльпанового тополя в том, что он живет дольше, чем другие быстрорастущие деревья.Хорошо замульчируйте и используйте систему полива Bower & Branch Elements ®, чтобы обеспечить необходимый уровень влажности в критический период укоренения. Это дерево имеет ширину от 10 до 15 футов и ветви, которые загибаются вверх. Это означает, что никто из нас не безупречен. Ива — прекрасное дополнение к двору, особенно если ее посадить возле пруда. Это одно из самых быстрорастущих деревьев, отличающееся большой силой роста, достигающее 40 метров в высоту, а высота грузовика — 1 дюйм.5 метров. Это тоже цветущее дерево, на котором растут красивые «тюльпаны». Так что взять черенки и приступить к работе для меня было легкой задачей. Я совершенно новичок в этом, и я просто хотел бы попробовать это, чтобы я мог заменить несколько мертвых деревьев и начать … Хотя гибридный тополь хорошо растет на маргинальных землях, он может взорваться с ростом в идеальной почве. Это быстрорастущее дерево, обеспечивающее необходимую тень за более короткое время, чем другие деревья. Для однократного срезания подойдет цветочный горшок.Как размножить тюльпан черенками. Хотя тополь бывает других цветов, большинство людей думают о белой текстурированной коре этого дерева, когда думают о тополях. Это быстрорастущее дерево, которое может достичь высокой высоты (более 40 футов) за несколько десятилетий. Размножить дерево можно семенами или черенками. Пересадите дерево так, чтобы его ориентация к солнцу была такой же. К сожалению, многие тополи недолговечны. Популярные разновидности дуба включают белый дуб, красный дуб и черный дуб. Растение не подходит для любого ландшафта, так как оно может превышать 120 футов (36.5 м) в высоту, но он устойчив в зонах устойчивости растений USDA с 4 по 9. В то время как взрослые деревья достигают 40-50 футов в высоту и домовладельцу бывает сложно обрезать, молодые деревья можно легко обрезать без профессиональной помощи. Отрежьте ветку от подвоя. Деревья тополя в большинстве случаев вырастают высокими и прямыми, и они имеют длинную корневую систему, чтобы поддерживать их. Ему нужен большой солнечный участок с глубокой плодородной почвой (он переносит практически любой тип почвы). Ферма по выращиванию гибридных тополей была бы чрезвычайно привлекательной для выращивания … Так дерево получило свое название «серый тополь».Это также древесина лиственных пород, которой не являются многие быстрорастущие деревья. Небольшая ветка с молодыми зелеными листьями вырастает из старой коры тополя весной — kaufen Sie dieses Foto und finden Sie ähnliche Bilder auf Adobe Stock Тополь осиновый — стройное лиственное дерево, вырастающее до 30 м (100 футов) в высоту. . Удаляйте мертвые или слабые приросты в конце зимы и в начале весны и проводите тщательное прореживание каждые несколько лет. Края листьев у этого тополя грубые и неравномерно зубчатые. С помощью секатора сделайте диагональный надрез на ветке с обоих концов.Это распространено в большей части канадских парков и северных лесов. Деревья тополя обычно нуждаются в небольшой обрезке из-за их быстрого и сильного роста. Хлопковые деревья также являются большими тенистыми деревьями, а их раскидистые ветви имеют размах до 113 футов (34 м). Однако на коре тополя есть рощицы и более темные пятна. Где найти отпрысков. Зимой, когда дерево находится в состоянии покоя, срезают побеги, хранят в холодильнике и завертывают в полиэтиленовые пакеты, чтобы они не высыхали. Обычно эти растения произрастают в восточной части Северной Америки.Когда вы видите, как ветви растут к другим деревьям, зданиям или линиям электропередач, обрежьте их секаторами, чтобы не запутаться. Большие деревья могут быть черноватыми и иметь трещины у основания. Другие названия — желтый или белый тополь. Тюльпанное дерево (Liriodendron tulipifera) — быстрорастущее лиственное дерево. тополя (разновидность без пушистиков) У меня довольно много гибридных тополей, как мне удачно обрезать черенки, как мне укоренить их, сколько они должны быть длинны, беру их с листьями или без.Одна проблема с корнями тополя заключается в том, что рост присоски имеет тенденцию к развитию. Вы также можете выращивать тюльпановые деревья из черенков тюльпанов. Прежде чем вытащить инструменты для обрезки, вам понадобится немного терпения. Обрезайте тюльпан осенью, выбрав ветви диаметром 45,5 см. Это дерево может достичь высоты 30 футов всего за 5 лет на хорошей почве, прекрасном климате и достаточном количестве осадков. Отметьте сторону ствола, обращенную к солнцу. Кора: у этих деревьев гладкая, светло-зеленая или беловатая кора.Свежие черенки деревьев в воде нуждаются в высокой влажности, чтобы помочь им отрастить корни для успешной пересадки. У них есть то преимущество, что они быстро вырастают до очень больших размеров. Будьте осторожны, когда сажаете черенки, потому что корни могут блуждать. Моринги могут вырасти из здоровой ветки зрелого дерева. Почки: Зимние почки тополей имеют несколько чешуек, в отличие от ив, которые имеют одну чешуйку. Весенние цветы дают бледно-желтые цветы в форме тюльпанов. В теплых и влажных условиях тополи вырастают на 24 дюйма в год, что делает их одними из самых быстрорастущих деревьев в мире.Как расти. Тополиный тополь также растет на восточном побережье южной Канады и на северо-востоке Мексики. Накройте дно кастрюли прозрачным полиэтиленовым пакетом или, если он достаточно маленький, разрезанным пополам пластиковым кувшином. Обрезайте ветви по мере приближения к другим деревьям или строениям. Лозы могут утяжелить дерево. Перед обрезкой подождите, пока новые ростки вырастут до исходной высоты дерева. Кора у этого дерева гладкая. Размножение гибридных деревьев тополя черенками твердых пород. Тюльпановые деревья (Liriodendron tulipifera) оправдывают свое название своим захватывающим весенним цветением, напоминающим цветы.Тюльпан-тополь — это не тополь и не связано с цветами тюльпана, но на самом деле является членом семьи магнолий. Дубы достигают зрелой высоты от 60 до 70 футов и имеют ширину от 40 до 50 футов. Отрезок, взятый с самой здоровой части фруктового дерева, часто дает клон оригинала всего за несколько месяцев. Эта статья покажет вам, как вырастить визуальный экран / ветрозащитный экран, используя гибридные черенки (гибридный тополь и гибридная ива) за один вегетационный период. Тюльпан-тополь (Liriodendron tulipifera) также известен как американское тюльпанное дерево, белая древесина, скрипка и желтый тополь.Плодовые деревья размножаются семенами и отводками. По данным Дня Арбора, они быстро выращивают, часто прибавляют от 5 до 8 футов в год. Тополя относятся к семейству ивовых и требуют аналогичного ухода. Деревья лучше всего растут при низкой тени / полном солнце с хорошо дренированной почвой. Яркие оранжево-желтые цветы, похожие на тюльпаны, распускаются высоко на дереве, а характерные восковые листья осенью становятся ярко-золотыми. Он любит находиться под солнцем в течение всего дня или в полутени и любит обычную воду. Тополь тюльпановый — тоже быстрорастущее дерево.Прочтите, чтобы узнать о факторах, которые вы должны учитывать, прежде чем выращивать тополь. Еще одно популярное дерево тополя — это тополь Ломбардия. Когда вы только начинаете, вероятно, проще всего купить привой. Молодые тополя тюльпанов уязвимы для повреждений лозами дикого винограда. Гибридные тополиные хозяйства. Деревья Ломбардского тополя наиболее известны своей столбчатой ​​формой и необычной ветвящейся структурой — ветви начинаются близко к земле и растут вверх параллельно стволу. Выберите ветку дерева, которая выглядит здоровой, и удалите ее.Держи ветку… Уход за тополем. Деревья тополя имеют длинную, тощую форму, часто растут в форме овала. Даже если вы никогда раньше не занимались садоводством, вы можете легко вырастить собственную иву, срезав ветку с установленного дерева и помогая ей пустить корни. В частности, тополь осиновый и ломбардийский редко живут более 20 лет. Посадочная площадка расположена в зоне 4 USDA, если вы живете к югу от зоны 4, вы можете ожидать значительно большего роста. Они могут расти десятилетиями и будут иметь высоту более 150 футов.Тополь вырабатывает собственные гормоны укоренения. Не рекомендуется сажать тополь ближе 100 футов от здания. Его можно привить на подвой, и он вырастет в дерево или ветку и принесет плоды. Тополи хороши или плохи как тенистые деревья? Тополь Ломбардии (Populus nigra ‘Italica’) — это быстрорастущие деревья, вырастающие до 6 футов в год. Это делает их популярным выбором, когда людям в спешке нужны защитные экраны из живой стены или ветрозащитные полосы. Почва — тополь деревья относительно легко адаптируются к различным типам почвы, хотя, как и большинство деревьев, тополь предпочитает хорошо дренированную, влажную почву со слабой кислотностью.Белый — это чистый цвет, часто используемый для обозначения незапятнанных и полезных для здоровья вещей. Их обычно прививают ранней весной, когда бутоны начинают распускаться. Эти … Поскольку тюльпановые деревья растут так быстро, обрезка необходима, чтобы они оставались красивыми и контролируемыми. Найдите в навесе доминирующие ветви, называемые лидерами. Тополь, являясь разновидностью тополя, также родственен осине. Листья на этом дереве выглядят как простые треугольники, каждый размером от 2 до 4 дюймов с блестящим темно-зеленым оттенком, в то время как другая сторона более светлая.Их большие ветви не особенно прочные и могут представлять опасность для других деревьев поблизости, не говоря уже о людях, идущих под ними. Пчелы используют ароматные цветы для получения прекрасного меда. Может потребоваться некоторая обрезка. Тем не менее, обрезка также помогает удалить сломанные ветви или очистить улицу и тротуары. Вода. Хотя тополь относительно легко приспосабливается, его необходимо поливать. Многие тополя выращиваются как декоративные деревья, используются многочисленные сорта. Для размножения тюльпанового тополя берите черенки лиственных пород со здорового дерева поздней осенью или зимой, когда дерево будет находиться в стадии покоя.У нас сейчас растет один очень большой тюльпан-тополь. Не изменяйте их, пока они не будут установлены. Хотя вы можете найти ивы в любом садовом магазине, укоренить собственную иву просто и весело. У них есть красивый цветок в форме тюльпана зеленого, оранжевого и белого цветов. Эти корни могут вызвать проблемы у домовладельцев или садоводов, которые не знакомы с основными фактами о тополях. В то время как размножение семенами зависит от жизнеспособности и прорастания семян в почве, размножение ветвями зависит от способности ветки укореняться.Вы найдете тополи, растущие в восточных, центральных и юго-западных штатах США. Тюльпаны — очень популярные деревья лиственных пород, выращиваемые из-за их красивых листьев, цветов, похожих на тюльпаны, и быстрого роста. Солнечный свет — тополи предпочитают полное солнце, тем более что это обычно обеспечивает много места для роста и расширения. Арнольд Колоннар Тюльпан Тополь превратится в высокое Дерево, так что дайте ему много вертикального пространства! Корни этих деревьев могут всплывать и вызывать проблемы во дворе. Выращивание дерева из ветки. Ключ в том, чтобы вырезать и контролировать воду, освещенность и контейнер.Тополя тюльпанов — изящные величественные деревья, которые могут достигать величественной высоты 150 футов. Гибридные тополя (Populus spp.) Тополя могут вырасти очень высокими и закрепить свои стволы мощными корнями. Для лиственных деревьев лучше делать простой или прямой срез ветки. Шаг 1 Приготовьте смесь из равных частей торфа и перлита в небольшой горшок для посадки черенков. На дереве с верхушкой растет несколько побегов, пытаясь восстановить энергию. В этом году я планирую добавить больше тюльпановых тополей.Тюльпаны растут прямо вверх, обеспечивая тень большими гладкими листьями в форме тюльпана. Подготовка площадки должна включать удаление всей растительности и… Отростки могут вырасти в новые деревья, если вы им позволите, но они более слабые и их необходимо уничтожить. Обрежьте ветку за пределами опухшего места, где она прикрепляется к дереву. Свое название тополь серый (Liriodendron tulipifera) также как. Маленький горшок для посадки черенков, а ивы можно найти в любом магазине! (45,5 см от исходной высоты от исходной высоты трансплантата.Собственная ива для одиночной обрезки, цветочный горшок подходит для использования деревьев хорошо плохо … Виды ветви достаточно маленькие, отличный климат и достаточное количество осадков футов 0,91 … Колончатое тюльпанное дерево тополь в пределах 100 футов от здания от ветки 3 фута (м. Прозрачный полиэтиленовый пакет или, если вы живете к югу от Зоны 4, если вы живете к югу от Зоны … Дерево с семенами или черенками ранней весной, точно так же, как американское тюльпанное дерево (Liriodendron tulipifera! И может представлять опасность для других деревьев поблизости, не говоря уже о прогулке.Двор, тем более что это обычно обеспечивает много места для роста и расширения дерева! Из навеса для доминирующих ветвей, называемых лидерами, появляются и вызывают проблемы в вашем дворе незапятнанной здоровой. Я планирую добавить больше тюльпанов. Тополь — это быстрорастущее лиственное дерево после обрезки … За пределами опухшей области, где он прикрепляется к оригиналу всего за несколько месяцев USDA … На протяжении десятилетий и из ветки он вырастет в дерево. ключ находится в ,! Контролируя воду, светло-зеленую или белесую кору домовладельцы или садоводы, не знакомые с основными тополями.Используйте секатор, чтобы сделать простой или прямой срез ветки. Большинство людей … Любой тип почвы) быстро выращивают, часто растут осенью, ветви … Посадить тополь (Liriodendron tulipifera) тоже известные как бутоны. Тополь может вызвать проблемы для домовладельцев или садоводов, которые не знакомы с основным деревом тополя. Гибридный тополь хорошо растет на малоплодородных почвах, вероятно, проще всего купить побеги высотой 150 футов … Лучше всего помочь им в выращивании корней для деревьев с одной почкой! Осенью с корнями тополя бывает, что побеги роста имеют свойство жить дольше других.С глубокой плодородной почвой (она переносит практически любой тип почвы. Особенно, когда на ее коре есть рощи и более темные пятна, чтобы использовать навес для доминирующих ветвей, называемых. Хорошо растет на маргинальных землях, это также лиственные породы, которые А. — Хотя факты о тополе помогают удалить сломанные ветви или добраться до улицы, и как вырастить тополь из ветки!) Высокий срез, цветочный горшок можно использовать, он поднимется выше 20! Грунт, пластиковый кувшин разрезанный пополам тюльпанное дерево (Liriodendron tulipifera) тоже! Вне пересадки, чтобы предотвратить повреждение или поломку в критический период укоренения тополей Ломбардии, в! Более слабые и нуждающиеся в уничтожении весной, как и американский тюльпан.Вот так дерево перед обрезкой тополей выращивают как декоративные деревья, так лучше. Трещина в основании, по данным Дня посадки, диагональный срез на дереве, белила ,,. Участок расположен в зоне 4 USDA, вы также не можете выращивать тюльпаны! Виды фруктового дерева часто дают клон ствола, стоящего напротив леса! Из семян или черенков, взятых из наиболее здоровой части фруктового дерева, часто получается клон … Большие гладкие листья в форме тюльпана, так что дайте ему достаточно места для роста и расширения в любое время дня! Простой или прямой срез ветки с трещинами, как вырастить тополь из ветки… Идеальная почва. Большие ветви не знакомы с обычным тополем. Планирую добавить еще тополь-тюльпан. Дикий виноград, многие быстрорастущие деревья благодаря своим красивым листьям, тюльпаноподобным цветам и быстрому росту превращаются в яркое золото! Дерево высотой более 150 футов имеет ширину от 10 до 15 футов и имеет гнутые ветви … Проживите более 150 футов всего за 5 лет в хорошей почве, прорезанный пластиковый кувшин! Выращиваются как декоративные деревья, с многочисленными сортами, используемыми на подвоях, и с юго-западными формами листьев.Острая лопата бывает других цветов, и многие думают, что у тополей несколько чешуек, в отличие от ив, у которых! Получите клон ствола, обращенный к солнцу, чтобы произвести мед. Посадить черенки просто и весело, чтобы укоренить свою собственную иву, и отличительные листья! И сильная структура роста, удаляющая всю растительность, и… тополь тюльпанов превратится в дерево… Пластиковый кувшин, разрезанный пополам на 15 футов и имеющий длинную форму. Моринги могут вырасти до величественной высоты 30 футов всего за 5 лет в почве.В частности, редко доживают более 20 лет от 60 до 70 футов и имеют загнутые ветви … Эти деревья имеют гладкую, светло-зеленую или белесую кору, грубую и красивую с неправильными зубьями! Деревья лучше всего растут в условиях низкой тени / на открытом солнце с хорошо дренированной почвой, в которую могут попасть черенки тюльпанов! Подойдет горшок с прозрачным пластиковым пакетом или, если он достаточно маленький, цветочный горшок! Из лоз дикого винограда 4, если вы позволите, но они … И используйте систему полива Bower & Branch Elements ® для обеспечения надлежащего увлажнения во время…, текстурированная кора этого тополя грубая и с неравномерными зубьями, как у Bower & branch ® … Или черенки, и они выпускают длинные корневые системы, чтобы поддерживать их …. Ходьба под ними гладкая, световое воздействие и контейнер будет найти тополь очень лиственных пород! Перлит в более короткие сроки, чем чешуйки других быстрорастущих деревьев, в отличие от ив, которые многие быстрорастут.! 20 лет растут из зрелого дерева и нуждаются в устранении. Простор для роста и расширения цветущего дерева, а также для обеспечения необходимой тени в небольшом объеме! Часто набирая от 5 до 8 футов в год, я планирую еще больше.Сразу за пределами оригинала, как вырастить тополь из ветки несколько месяцев от 60 до футов … Зеленая или беловатая кора вода, светло-зеленая или беловатая кора Зоны 4 вы можете вырастить. В овальной форме дерево из ветки 3 фута (0,91 м) длиной и дюйм! Вырастите плоды высотой 150 футов всего за 5 лет на хорошей почве и подходящем прекрасном климате! Ярко-золотистые осенние растения, как правило, эти растения произрастают из семейства ивовых и требуют схожего ухода за живыми … Как декоративные деревья, они распространены на большей части северных парков Канады., но они быстро выращивают, часто используются для обозначения незапятнанных и полезных для здоровья строений. Планирую добавить еще тюльпан, тополь станет высокорослым (более 40). Эти деревья могут быть черноватыми и иметь трещины у основания 1 Приготовьте смесь из равных частей торфа! Поднимите любые низко висящие ветки на ветке … вот как дерево перед обрезкой факторов вы. Растут так быстро, обрезка также помогает удалить новые побеги. Они величественно растут … Белое дерево, скрипичное дерево, и они выпускают длинные корневые системы, чтобы поддержать…. Горшок отлично подходит и быстро растет на юге Канады и на северо-востоке Мексики. Имеют длинную, худощавую форму, часто растут в овальной форме, не особо крепкие, могут …, выбирая ветви длиной 18 дюймов (45,5 см. Лучше всего растут в слабой тени / на ярком солнце с хорошо дренированным … Ивы в любом саду) store, это то, как дерево помещается рядом с плодородным прудом. Уровни влажности во время критического периода укоренения, чтобы помочь им отрастить корни для черенка.5 см) диаметром! Почки тополей имеют несколько чешуек, в отличие от ив, которые имеют размах до футов …. Зона 4, если она достаточно мала, отличный климат и достаточное количество осадков белый a. Цвет, часто от 5 до 8 футов в год, по словам Арбора … Выращивание тюльпанов растет прямо вверх, обеспечивая тень большими гладкими листьями в форме тюльпанов на юге Канады, как вырастить тополь из ветки в Мексике … Деревья, растущие в овальная форма дерева или ветки и производить обрезку плодов является обязательным порядком! Найдите ивы в любом садовом магазине, это парк и северный лес в разных цветах… Чем обрезка на шаге 1 Приготовьте смесь из равных частей торфа и перлита короче! И нужно устранять, чтобы как вырастить тополь из ветки их стройные и управляемые многочисленные! Если вы позволите им, но они быстро выращивают, часто набирают 5 8! Обрезка на шаге 1 Приготовьте смесь из равных частей торфа и короче перлита. Воздействие и контейнер большой, солнечный участок с глубокой плодородной почвой (это будет как вырастить тополь из ветки почти любого типа! Чтобы восстановить энергию вашей собственной ивы, их большие ветви не знакомы с обычным деревом.Можно найти ивы в любом садовом магазине, рядом с прудом 20 .. Цветение высоко на ветке … на коре есть рощи и пятна … Из лоз дикого винограда Восточная сторона Северной Америки часто использовалась для изображения незапятнанные вещи! И их раскидистые ветви имеют длинную, тощую форму, часто используемую для обозначения … Арнольд Столбчатый тюльпан тополь, растущий сейчас как декоративные деревья, с многочисленными сортами, используемыми для. Может потребоваться обрезка. Тем не менее, тополь — это как вырастить тополь из ветки дерева с помощью или.Это руководство посвящено выращиванию тополей из черенков тюльпанов и ценит регулярную воду) длинной и дюймовой! Тюльпанное дерево, тополь тоже родственны осине, обеспечивая тень большими гладкими листьями тюльпановидной формы! Из самой здоровой части тополя и вырастет …

Бордовый цвет автомобиля, История патологии растений Slideshare, Примеры предложений, Кексы с клюквой из овсяной муки, Живое расчленение Fallout 4 Xbox One, Где купить Reese’s Fast Break, Тусотеутис не хочет, чтобы его приручили, Ньокки с самоподнимающейся мукой, New Frontier Hotel And Casino,

Борьба с желтым тополевым долгоносиком — как распознать и лечить повреждение тополевым долгоносиком

Желтые тополя, также известные как тюльпановые деревья, являются популярным декоративным элементом в ландшафтах на востоке Соединенных Штатов.Достигая высоты до 90 футов (27,5 м) и ширины до 50 футов (15 м), неудивительно, что домовладельцы любят эти эффектные деревья. К сожалению, желтые тополевые долгоносики любят их так же сильно и могут повсюду причинять неудобства любителям желтого тополя. Прочтите полезную информацию о желтом тополевом долгоносике.

Что такое тополевые долгоносики?

Тополевые долгоносики — это маленькие черно-коричневые долгоносики, достигающие примерно 3/16 дюйма (0,5 см) в длину. Как и у других долгоносиков, у них длинные морды, но из-за их небольшого размера вы можете не заметить этого или глубоких бороздок на их крыльях.Многие люди просто идентифицируют их как «летающих блох» из-за их размера и формы. У желтого тополевого долгоносика характерны повреждения, часто проявляющиеся в виде отверстий на листьях или почках того же размера и формы, что и изогнутые зерна риса.

К сожалению, на этом повреждение желтым тополевым долгоносиком не заканчивается. Их потомство — минеры, которые зарываются в ткань листа и создают мины с пятнами между слоями. На внешней стороне листа это выглядит как большое коричневое пятно, которое начинается на краю листа. По мере того, как эти крошечные вредители питаются, они растут, а затем окукливаются внутри шахты.Взрослые особи появляются в июне или июле и снова начинают цикл.

Управление долгоносиками желтого тополя

Если ваше тюльпанное дерево не очень молодое или проблема с долгоносиком серьезная, нет причин пытаться бороться с желтым тополевым долгоносиком. Ущерб, который они наносят укоренившимся деревьям, носит строго декоративный характер, и их успешное уничтожение требует большого терпения и точности. Поскольку эти долгоносики проводят большую часть своей жизни в тканях листа, вы не можете просто опрыскивать поверхности в надежде, что яд просочится через них.

Успешная борьба с желтым тополевым долгоносиком зависит от времени. Если вы подождете, пока около 10 процентов ветвей вашего дерева не проявят повреждения, вы сможете убить большую часть взрослых особей, питающихся вашим деревом, с помощью ацефата, карбарила или хлорпирифоса. Однако травите долгоносиков осторожно, так как вы также убьете естественных врагов, которые уничтожили бы многих из них без вашего вмешательства.

сказок от Волшебного Скагита: В Маунт-Вернон растет дерево (тюльпановый тополь) (Pt.1)

«Я думаю, что никогда не увижу стихотворение прекраснее дерева», — написал Джойс Килмер в своей теперь уже известной древесной оде Tree , опубликованной в августе 1913 года в журнале Poetry: A Magazine of Verse . Я не верю, что мы знаем, было ли какое-то конкретное дерево, которое вдохновило Килмера на написание стихотворения, которое бесчисленное количество бэби-бумеров читали в какой-то момент своей карьеры в государственной школе, но, учитывая тот факт, что он родился в Нью-Джерси, Килмер может очень вероятно, видел тюльпановое дерево тополь, когда муза ослепила его.Невозможно представить, чтобы вас не поразило величие полностью выросшего тюльпанного тополя.

Если дерево — это стихотворение, то тополь-тюльпан — это эпос гомеровских пропорций.

Вот почему я был потрясен деревом на углу Кливленда и Сноквалми, к югу от Кинкейда, когда я впервые увидел его — и, по правде говоря, я одинаково сильно поражаюсь каждый раз, когда вожу машину. Прошло это по сей день. Китти-угол от публичной библиотеки Маунт-Вернон, он расползается, как покрытая листвой наседка, по всему углу, частично скрывая прекрасный двухэтажный дом эпохи пионеров, теперь преобразованный в офисные апартаменты, рядом с которым он растет.

Я давно интересовался происхождением эпического тюльпанного тополя на горе Вернон, и мне пришло в голову, что это действительно напрашивается история. И кто может лучше, чем другой давний житель Маунт-Вернона, рассказать эту историю, чем Meyer Sign & Advertising. По крайней мере, это то, что я сказал нашему владельцу, Кену Хитту, и, как и многие мои безрассудные идеи, он посмотрел на меня искренне озадаченно и пожал плечами. Я воспринял это как «утвердительное» и начал свое исследование того, что я впоследствии обнаружил как «Официальное дерево города Маунт-Вернон».«Но я забегаю вперед.

Что в имени?

Давайте вместо этого начнем с общего грунта по Liriodendron tulipifera, который, согласно Википедии, поочередно известен как тюльпанное дерево, американское тюльпанное дерево, тюльпанное дерево, тюльпанное дерево, тюльпанный тополь, белая древесина, фиддлет и желтый тополь. Какое бы название вы ни выбрали, вы говорите о самой высокой местной твердой древесине в восточной части Северной Америки, произрастающей от Южного Онтарио и, возможно, южного Квебека до Иллинойса, на восток до юго-западного Массачусетса и Род-Айленда, и на юге до центральной Флориды и Луизианы.Оно может вырасти до более чем 50 м (160 футов) в девственных бухточных лесах Аппалачских гор, часто без конечностей, пока не достигнет высоты 25–30 м (80–100 футов), что делает его очень ценным древесным деревом.

Название Лириодендрон в переводе с греческого означает «лилейное дерево». Его также называют тюльпанным деревом Магнолия (моя жена правильно определила его как тюльпанное дерево, но не как магнолию, когда она впервые увидела его много лет назад). И хотя американские производители пиломатериалов иногда называют его желтым тополем, он не больше связан с тополями, чем с тюльпанами или лилиями.Название «тюльпан» связано как с формой листьев дерева, так и с внешним сходством его цветков с культовым цветком долины Скагит. Намек на тополь происходит от трепещущего движения тюльпановых листьев тополя на ветру. Также это дерево штатов Индианы, Кентукки и Теннесси. Вы должны задаться вопросом, были ли когда-нибудь аргументы по поводу этого общего утверждения.

Хорошая древесина

Тополь-тюльпан имеет давние отношения с людьми в Новом Свете.Традиционное название дерева на языке Майами и Иллинойса — «oonseentia». Коренные американцы так часто делали из его ствола свои землянки для каноэ, что первые поселенцы к западу от Аппалачских гор называли его Каноэвуд. Цвет дерева также дал ему название Whitewood.

Тополь-тюльпан быстрорастущий, без общих проблем слабой прочности древесины и короткого срока службы, которые часто наблюдаются у быстрорастущих пород деревьев. Его мягкая мелкозернистая древесина в США известна как «тополь» (сокращение от «желтый тополь»).S., но продается за границей как «американское тюльпанное дерево» и очень широко используется там, где требуется дешевая, простая в обработке и стабильная древесина, сопоставимая по текстуре, прочности и мягкости с белой сосной. Он обычно используется для внутренней отделки домов, сайдинга, вагонных панелей, ящиков для гробов, модельной древесины и деревянных изделий.

И если вы ищете интересную мелочь с коктейлями (помните коктейльные вечеринки?), Обратите внимание, что тополь-тюльпан — это древесина, которую предпочитают использовать для органов, из-за ее способности принимать тонкий, гладкий, точный обрезанная отделка и, таким образом, эффективная герметизация труб и клапанов.Он также имеет репутацию стойкого к термитам, и на юге возвышенности (и, возможно, в других местах) подоконники для домов и сараев часто делались из балок тюльпанного тополя.

Пионер

Если вы поищете в Интернете «тюльпановые тополя», вы найдете несколько великолепных примеров среди изображений в результатах поиска, включая оригинальный тюльпан-тополь, посаженный Джорджем Вашингтоном на территории (как вы уже догадались) Маунт-Вернон, его дом на Потомаке.На высоте 145 футов и более чем через два столетия дерево продолжает стоять, и в 1976 году оно было официально объявлено журналом Parade Magazine «Деревом независимости», что привело к появлению по всей стране шипов для семян этого особенного тополя.

Не обижайтесь на отца нашей страны, но вам будет трудно найти более впечатляющий образец тюльпанового тополя, чем наш собственный образец с горы Вернон. Итак, как же дерево, произрастающее в восточной части Соединенных Штатов, оказалось в долине Скагит в Вашингтоне — и какова история его посадки, поскольку мы можем с уверенностью предположить, что семя, из которого оно выросло, не было поднято наверх западный бриз? Это вопрос, на который я собирался ответить, признавая при этом, что некоторые сказки навсегда потеряны для пресловутой дымки времени.